Examenvragen Histologie (BMW – 1e bachelor) - (2023-2024)
1) Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Wat
kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt
worden voor deze methoden en waarom?
Boek p.3-7 + 10-11
Notities p.1
Bij conventionele lichtmicroscopie wordt er zichtbaar licht gebruikt als bron, en soms ook lasers om
de foutmarge van het beeld te verkleinen. De techniek met lasers noemen we confocale
lichtmicroscopie. Het duurt langer dan wide-field lichtmicroscopie, maar geeft een meer
gedetailleerd beeld. Met een lichtmicroscoop kan men al een heel wat dingen onderzoeken zoals
levende cellen via Brightfield en fase-contrast microscopie (geeft de mogelijkheid om mitose/meiose
waar te nemen bv). Daarnaast kan men ook aan de hand van fluorescente microscoop bepaalde
moleculen detecteren door hunne gelabelde/fluorescente antistoffen. Staalbereiding is niet zo
moeilijk bij conventionele lichtmicroscopie. Afhankelijk van wat men wilt onderzoeken kan men het
preparaat levend, gefixeerd (met formaldehyde of glutaaraldehyde) of ingevroren bekijken. De
resolutie dat men kan behalen met lichtmicroscopie ligt rond de 200 nm wat maakt dat virussen en
kleinere partikels niet zichtbaar zijn met een lichtmicroscoop.
Voor partikels kleiner dan de resolutie van lichtmicroscopen kan men een
elektronenmicroscoop(TEM) gebruiken (resolutie= 0,1 nm). Hieronder vallen virussen, DNA,
individuele moleculen/ atomen etc. In plaats van zichtbaar licht beschiet men het preparaat met
elektronen via een vacuüm elektronenbuis. Als de buis niet vacuüm zou zijn, zouden de elektronen
interageren met de vrije zuurstofmoleculen wat leidt tot een vervuiling van het beeld. Het TEM werkt
als volgt: een dikke laag laat niet veel elektronen door en resulteert in een donker beeld. Anderzijds
laten dunne lagen heel veel elektronen door en geeft dus een licht beeld. Dit wordt uiteindelijk
weergegeven op een scherm en is niet zoals lichtmicroscopie waarneembaar met een oculair. Om
het contrast tussen dikke en dunne lagen beter weer te geven kan men aan Os-kleuring doen. Een
techniek waarbij men Os moleculen toevoegt aan het preparaat waardoor Os makkelijk bindt aan de
membranen en dus dikkere lagen creëert. Preparaten dienen gefixeerd te zijn met glutaaraldehyde
om vetten te bewaren (sterkere fixatie dan formaldehyde wegens 4 c atomen in plaats van 1) en
kleiner gesneden te zijn (20nm). Een nadeel van elektronenmicroscopen is dat men enkel een zwart-
wit beeld kan genereren.
2) Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de staalpreparatie
voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Boek p.8-9
Notities p.2
Bij de staalpreparatie voor histologie worden formaldehyde en glutaraldehyde gebruikt om het
weefsel te fixeren, met als doel de weefselstructuur zo goed mogelijk te bewaren. Dit proces omvat
verschillende stappen.
Allereerst wordt het weefsel ondergedompeld in fixatievloeistof, waarbij zowel formaldehyde (met
korte verbindingen) als glutaraldehyde (met lange verbindingen) worden gebruikt. Deze chemicaliën
werken door crosslinking van eiwitten, wat resulteert in covalente bindingen met N-terminale
groepen. Hierdoor worden de eiwitten vastgehecht aan het cytoskelet en aan andere interagerende
eiwitten, waardoor de structuur van het weefsel zoveel mogelijk behouden blijft.
De duur van de fixatie varieert meestal tussen de 2 en 24 uur, afhankelijk van het specifieke protocol
en het type weefsel.
Er zijn echter ook nadelen verbonden aan dit fixatieproces. Ten eerste worden niet alleen eiwitten,
maar ook DNA en RNA gecrosslinked, waardoor genetische analyse bemoeilijkt of zelfs onmogelijk
wordt. Daarnaast kan er een verlies van enzymatische werking optreden.
,Om het weefsel verder te verwerken voor histologische analyses zijn er nog enkele tussenstappen
nodig, zoals paraffine-ingieting, dehydratatie met behulp van concentratiegradiënten van alcohol, en
uitspoeling met xyleen.
Bij het gebruik van fixatievloeistoffen is het belangrijk om een voldoende hoeveelheid te gebruiken,
doorgaans minstens 5 keer het volume van het weefsel.
Voor lichtmicroscopie wordt meestal een waterige oplossing op basis van formaldehyde, bekend als
formol, gebruikt. Voor elektronenmicroscopie daarentegen is glutaraldehyde een sterker fixatief dan
formaldehyde.
3) Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en immunofluorescentie.
Boek p.14-16
Notities p.2-3
Onderzoeksmethoden zoals immunohistochemie en immunofluorescentie zijn beide gebaseerd op de
interactie tussen antilichamen en specifieke antigenen in weefselmonsters.
De gelijkenissenzijn dat beide methoden maken gebruik van antilichamen die reageren met
specifieke antigenen in weefsels en beide kunnen worden toegepast voor diagnostische,
prognostische en therapeutische doeleinden in de geneeskunde en biologie.
De verschillen zijn:
1. De detectie: Immunohistochemie gebruikt enzymatische reacties of biotine-gelabelde
antilichamen met chromogene substraten voor zichtbare kleuring, terwijl immunofluorescentie
antilichamen gebruikt die gebonden zijn aan fluorescerende moleculen voor directe zichtbaarheid
onder een fluorescentiemicroscoop.
2. De signaalversterking: Immunohistochemie maakt gebruik van enzymatische reacties en
chromogene substraten voor signaalversterking, terwijl immunofluorescentie inherent een sterker
signaal heeft vanwege de fluorescentiemoleculen.
3. De specificiteit: Immunohistochemie kan soms minder specifiek zijn vanwege mogelijke
kruisreacties, terwijl immunofluorescentie vaak een hogere specificiteit heeft vanwege de directe
binding van fluorescerende moleculen aan antilichamen.
4. De toepassingen: Immunohistochemie wordt vaak gebruikt voor vaste weefselsecties in paraffine
voor diagnostische doeleinden, terwijl immunofluorescentie vaak wordt toegepast voor onderzoek
naar levende cellen of weefsels en intracellulaire processen.
4) Bespreek directe, indirecte en ge-ampificeerde immunohistochemie en immunofluorescentie.
Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Boek p.14-16
Notities p.2-3
Directe immunohistochemie en immunofluorescentie zijn methoden waarbij het antilichaam direct
gelabeld is, wat betekent dat het antilichaam zelf het detecteerbare label draagt. Deze technieken
zijn snel en eenvoudig, maar bieden doorgaans minder signaalversterking en zijn minder gevoelig
voor het detecteren van lage hoeveelheden antigeen.
Indirecte immunohistochemie en immunofluorescentie maken gebruik van een primaire antilichaam
dat niet gelabeld is. Na incubatie met het primaire antilichaam wordt een secundair antilichaam
toegevoegd dat wel gelabeld is en bindt aan het primaire antilichaam. Deze methode biedt meer
signaalversterking en is gevoeliger voor het detecteren van lage hoeveelheden antigeen.
Geamplificeerde immunohistochemie en immunofluorescentie zijn varianten waarbij extra stappen
worden toegevoegd om het signaal verder te versterken. Dit kan worden bereikt door bijvoorbeeld
het gebruik van enzymatische reacties met chromogene substraten of door het toevoegen van
meerdere gelabelde moleculen die binden aan het antilichaam, waardoor het signaal aanzienlijk
wordt verhoogd.
Deze verschillende afgeleide methoden bestaan om de gevoeligheid, specificiteit en
signaalversterking van immunohistochemie en immunofluorescentie te verbeteren, afhankelijk van
de vereisten van het specifieke experiment of de analyse.
,Directe zou kunnen gebruikt worden in heel simpele voorbeelden waar het te onderzoeken eiwit kan
worden gevisualiseerd.
Indirecte zou men bv eerder gebruiken bij het visualiseren van virussen. Een bekend voorbeeld het
spike-virus waarbij men gaat werken door een antistof te gaan binden op het al aanwezige.
Geamplificeerde wordt eerder gebruikt wanneer het signaal zelf niet zo sterk is en moeilijk
waarneembaar is met het blote oog.
5) Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens operatie en
diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap kort toe.
Notities p.2
Men begint bij het operatief wegenemen van weefsel dat zich dus in levende toestand bevindt.
Vervolgens vriest men het weefsel in met vloeibare stikstof bij -80°C(zeer snel en dus het meest voor
de hand liggend tijdens operatie). Hoe sneller het ingevroren is, hoe hoger de kwaliteit. Zo kan het
weefsel lang bewaard worden. Het weefsel kan ook gefixeerd worden met behulp van
formaldehyde/glutaaraldehyde (covalente bindingen vormen met N uiteinde eiwit). Hier is de
kwaliteit minder goed omdat DNA/RNA kan fragmenteren (en duurt veel langer), maar de
mogelijkheid om te onderzoeken is veel groter dan bij invriezen. Na fixatie kan men het weefsel
impregneren met paraffine om H2O te onttrekken aan de hand van ethanol en xyleen. Vervolgens
worden er paraffine blokjes gegoten. De paraffine blokjes worden dan gesneden met het microtoom.
De coupes worden gesneden met een dikte van 2-5mm en vervolgens op een draagglaasje geplaatst,
waarmee het gemonteerd kan worden op de microscoop. De paraffine coupes kunnen ook gekleurd
worden, afhankelijk wat er onderzocht wordt.
6) Geef een overzicht van de verschillende types kleuringen die courant gebruikt worden in de
histologie? Leg kort principe en doel van de diverse types kleuringen uit.
Boek p.12-14
Haematoxyline-eosine kleuring
Doel: De zure elementen worden blauw gekleurd en basische elementen worden rood
gekleurd
Principe: Hameroxyline, een basische kleurstof bindt aan zure elementen voornamelijk in de
kern te vinden. Eosine, een zure kleurstof bindt aan basische elementen. Vooral in het
cytoplasma en collageen in de extracellulaire matrix.
Empirische kleuring
Doel: Verschillende componenten in weefsels kleuren zoals bijvoorbeeld botten en spieren
die een andere kleur krijgen bij trichoomkleuring, of DNA en eiwitten zichtbaar maken door
zilverkleuring.
Principe: Cellen kleuren op basis van de lading van de moleculen in de kleurstof.
Histochemische kleuring
Doel: De aanwezigheid van chemische stoffen aantonen. Bijvoorbeeld de aanwezigheid van
koolhydraten aantomen met de Periodic Acid Schiff(PAS).
Principe: Een specifieke chemische reactie van het weefselcomponent met een chemische
verbinding in de kleurstof.
Enzymhistochemische kleuring
Doel: Bepaalde enzymen aankleuren in een weefsel. Bijvoorbeeld de aanwezigheid van
peroxidasen aantonen door gebruik te maken van DAB.
Principe: Kleuren op basis van de activiteit van een enzym dat aanwezig is in het te
onderzoeken weefsel. Dit kan enkel als de enzymatische activiteit bewaard blijft in de
vriescoupes.
Immunohistochemische kleuring
Doel: bepaalde antigenen waarneembaar maken.
, Principe: Specifieke antistoffen binden antigenen om een immuuncomplex te vormen. De
antistof wordt vaak gebonden aan een fluorescerende molecule, enzym, biotine of
goudpartikel om het complex waarneembaar te maken.
7) Bespreek 3 toepassingen van immunohistochemie en hoe deze kunnen helpen bij pathologische
diagnostiek.
Boek p. 16
Diagnostisch: vb: Een patiënt heeft een levermetastase van een ongekende primaire tumor. De
tumor is epitheliaal met klierdifferentiatie en er wordt gedacht aan een metastase van een
longtumor of colontumor. Beide tumoren kunnen eenzelfde histologisch beeld hebben maar bezitten
andere types van cytokeratines. Op basis van het immunohistochemisch resultaat voor cytokeratine
7 en cytokeratine 20 kan men dan het onderscheid maken tussen een tumor van longorigine
(CK7+CK20-) en een tumor van colonorigine (CK7-CK20+)
Prognostisch: vb: patiënten met een carcinoom van de oropharynx dat p16 (een tumorsuppressor
eiwit) positief is reageren beter op radiotherapie.
Therapeutisch: vb: steeds meer tumoren worden behandeld met doelgerichte therapie (targeted
therapy). Bij 1/5de van de patiënten met borstcarcinoom zijn de tumorcellen positief voor HER2, een
groeifactor receptor die overgeactiveerd wordt in borstkanker. Enkel deze patiënten
die HER2 overexprimeren zijn gebaat bij een behandeling met Herceptin, een gehumaniseerd
monoklonaal antilichaam tegen HER2. Deze behandeling kost echter wel 35.000 € per patiënt per
jaar en wordt enkel aan patienten terugbetaald die HER2 positief zijn.
8) Bespreek het principe van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Wat kan je met deze methode
bestuderen?
Boek p.11
In tegenstelling tot transmission elektronenmicroscopie kijkt men niet in de cel maar naar de
oppervlakte. Het is een zeer specifieke techniek waarbij men elektronen schiet op de oppervlakte
van een membraan/virus etc. die uiteindelijk zullen terugkaatsen via een specifieke hoek (sinus î=
sinus j) en zullen worden waargenomen via een detector. Het is een proces dat zeer veel rekenwerk
vergt met als gevolg dat het langer duurt dan TEM vooraleer een beeld zichtbaar is. Doordat er met
elektronen gewerkt wordt kan men een zeer gedetailleerd beeld van zeer kleine organismen/cellen
verkrijgen (resolutie 0,1 nm). Voor biologische samples wordt hiervoor een detecteerbare laag
aangebracht (bv een dunne laag goud partikels) op het oppervlak van het staal en kan met grote
precisie een oppervlak worden bestudeerd. Qua opbouw van de SEM zit er, waar normaal gezien een
preparaat ligt bij TEM, een scanning coil en bevindt het preparaat zich helemaal onderaan de
opstelling.
9) Bespreek de structuur en componenten van de buitenste plasmamembraan. Welke types van
transport gebeuren er over de membraan? Geef een overzicht.
Boek p.18-21
De functie van biomembranen is het compartimentaliseren van biologische processen. Zo zorgt de
cellulaire plasmamembraan voor een goede aflijning van cellen onderling en de extracellulaire
matrix. Biomembranen grenzen ook gespecialiseerde intracellulaire componenten of (oa.
celorganellen).
Biomembranen zijn opgebouwd uit vetten(35%), membraan eiwitten(60%) en suikers(5%) .
De specifieke samenstelling van de diverse lipiden, eiwitten en suikers is variabel en afhankelijk vaan
de functie van de cel. De belangrijkste stoort lipiden zijn fosfolipiden. Ze hebben een hydrofobe
staart en hydrofiele kop. In waterig milieu schikken ze zo dat ze een bolvormige structuur vormen,
waarbij de hydrofobe delen naar elkaar gericht zijn en de hydrofiele delen naar het waterig milieu.
Als er zowel binnen als buiten deze bol water is, ontstaat er een dubbellaag. In een membraan zijn de
