Samenvatting omvat alle hoofdstukken van het vak "Advanced Protein technology and proteome analysis", gegeven door professor Van Ostade en professor Boonen. De cursus wordt gegeven in 1ste master Moleculaire Mechanismen van Ziekten en behandelt diepgaand de technieken en toepassingen binnen de eiw...
Bottom-up
De meest gebruikte techniek bij proteomics is bottom-up:
eiwitten worden geknipt in kleinere peptiden om deze
peptiden te identificeren op basis van hun fragmentatie
spectrum. Eiwitten kunnen intact zijn maar dit is significant
moeilijker omdat de interpretatie van eiwit fragmentatie
spectra moeilijk is.
1.0.2 VERLOOP VAN PROTEOMICS
1.0.3 SHOTGUN PROTEOMICS
Shotgun proteomics
● Start van cellen → eiwitextractie → complex proteïne staal → tryptic digest → complex peptide staal →
peptide scheiding via LC → minder complex peptide staal → verzamel zoveel mogelijk fragmentatie spectra
van een monster en identificeer ze → MS software selecteert peptiden voor fragmentatie gebaseerd op wat
is gedetecteerd in MS1 = data dependent acquisition (DDA)
→ Shotgun is meestal bottom-up.
,Shotgun proteomics is zoals genome sequencing MAAR
● Er is geen amplificatie stap → dynamische range is gelimiteerd
● Meestal niet mogelijk om een complete eiwitsequentie te krijgen van complexe stalen
○ Dit is al een uitdaging bij gezuiverde eiwitten, omdat sommige peptiden misschien moeilijk te
meten zijn (vanwege ionisatie verschillen).
● Protein interferentie probleem
● Complexiteit neemt toe van DNA → RNA → eiwitten
1.0.4 TOEPASSINGEN
Massaspectrometrie-gebaseerde technieken worden momenteel veel gebruikt voor het beantwoorden van
verschillende vragen in proteomics (we zijn meestal niet geïnteresseerd in het sequencen van eiwitten).
➔ Toepassingen van proteomics in de biowetenschappen
➔ Vergelijken van protein profielen gezondheid/ziekte
➔ Wat is de concentratie van een eiwit in een sample (biomarker)?
➔ Is het PTM-profiel (post-translationele modificatie) anders bij gezondheid/ziekte?
➔ Welke proteïnen interacteren met elkaar in de cel?
➔ Spatiale locatie van proteïnen
➔ Wat is het effect van een SNP op proteoforms?
➔ …
Op basis van wat je wilt onderzoeken, moet je andere sample preparation doen.
,1.1 SAMPLE PREPARATION
Doel les
In deze cursus maak je kennis met protocollen voor sample prep in de praktijk.
De doelen van deze cursus zijn
● Je vertrouwd maken met de protocollen zodat je deze herkent bij het lezen van werkstukken
● De trends in monstervoorbereiding uitleggen
● Enkele voorbeelden geven van meer geavanceerde onderzoeksvragen en hoe deze worden opgelost.
● Je hoeft de exacte protocollen niet uit je hoofd te leren! Het is belangrijk om het idee erachter te begrijpen
→ enkel algemene stappen kennen voor het examen
→ verder vermelde protocollen niet vanbuiten kennen
→ waarom wijken huidige protocollen af van standaardprotocol? Geef 1 voorbeeld.
- Bv. eiwitten zijn minder stabiel dan nucleotiden
- Temperatuur, pH anders, …
1.1.1 ALGEMENE STAPPEN
Algemene stappen in sample preparation
1. Wetenschappelijke vraag - experimenteel ontwerp : definiëren wat je wil doen/wat probleem is
2. Literatuurstudie : is er al iets gelijkaardigs gebeurd?
3. sample collection: liefst verse stalen die zo snel mogelijk gestabiliseerd zijn
4. Proteïne extractie- oplosbaar maken
5. Proteïne scheiding of -zuivering (optie)
6. Reductie en alkylering
7. Digestie
8. Peptiden zuivering of -selectie
9. Prefractionering (optie)
➔ Definieer je onderzoeksvraag
➔ Kies je protocol op basis van stap 1, er zijn veel verschillende protocollen voor specifieke doeleinden
➔ Zorg ervoor dat de samples die je gebruikt van de hoogst mogelijke kwaliteit zijn en voorkom afbraak
voorkomen (protease- en fosfatase remmers)
Belangrijke opmerking!
Belangrijk om contaminatie te vermijden: lage hoeveelheden eiwitten kunnen meten, maar door contaminatie gaat
dit moeilijk worden → MS zeer gevoelig voor deze contaminatie
1. Maak altijd verse buffers
1. Gebruik oplosmiddelen en buffers van LC-MS kwaliteit.
2. Pipetteer nooit direct vanuit een stockoplossing of oplosmiddel, gebruik een bekerglas
Veel voorkomende contaminanten : plasticizers ((zoals polyethyleenglycol, PEG) en keratine)
, KLEINERE STALEN
1 van de redenen dat protocollen verandert zijn = kleinere stalen
● Staal volume kan beperkt zijn (bv. tumor biopsies)
● Single cell data is nodig (bv. tumoren zijn heel heterogeen) → gevoelig kunnen meten op single cell niveau
● Zeer gevoelige technieken kunnen snel gesatureerd zijn bij grotere stalen en zo de dynamische range
verkleinen. Meer startmateriaal gebruiken is niet altijd een voordeel.
Nadelen van kleine stalen
● In een cel : eiwitconcentraties variëren
● Kleine stalen gaan snel verloren doordat eiwitten binden aan oppervlakken (buisjes, pipetpunten),
switching valves en de stationaire fase van de LC.
● Kleine volumes zijn nodig om de concentratie te verhogen en zo de detectielimiet te verlagen.
→ In het algemeen wijkt de proteomics sample prep in artikelen daarom af van de "basics" om bovenstaande
problemen te minimaliseren
Oplossing
Om deze problemen op te lossen moet men zo gevoelig mogelijk meten:
● Zo weinig mogelijk het staal transporteren: van 1 epje naar het andere (examples 1-4)
● Volume zo klein mogelijk houden (5-8)
● Opp satureren zodat staal er niet meer aan kan plakken met (e.g. with albumin or
n-dodecyl-𝛽-D-maltoside)
Automatiseren
Automatisering en standaardisatie zijn vereist bij het gebruik van grote aantallen samples→ dus miniaturisatie en
robotisering zijn beide gewenst
COMBINEREN VAN TECHNIEKEN
Verschillende vormen van proteomics zorgen ook voor variatie in protocollen
● Proteogenomics
● Phosphoproteomics
● Interactomics
● …
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur biomedicalscientist2022. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €15,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
