Dit document omvat de info van de slides plus mijn lesnotities van les 5 van concepts, gegeven door Xaveer van Ostade. De lessen van Kurt Boonen (Les 2,3,4 en 8) heb ik ook, maar de notities staan op de slides. Moest je hierin ook geïnteresseerd zijn, mag je me altijd contacteren via messenger :))
Lecture 9: 12/12
LC-MS
- HPLC: beat smaller diameter -> pu5 larger pressure on the column so that the solvent
goes through the column
- Separa=on of complex mixtures of proteins and pep=des, immediately followed by
mass spectrometric analysis of the separated components.
- Online connec=on of chromatography to the ESI source: eluted and separated pep=des
are directly sent into the mass spectrometer where the MW (MS scan) and the AA
sequence (MS/MS scan) are determined.
- 1 duty cycle is the =me the MS needs to perform 1 MS scan and several MS/MS scans
of the highest peaks (see below)
- You can direct elute the elusion in the ESI source
o You don’t lose sample
- If we have complex mixtures of pep=des and proteins -> you elute several pep=des
simultaneously from the column -> MS cannot follow
- Eluted pep=des are directly introduced in the MS -> MS scan and MS-MS scan
- Since an MS/MS scan demands some =me and chromatography runs con=nuously, a
selec=on must be made of the ions (precursors) that have to undergo an MS/MS scan:
o In prac=ce the mass spec runs 1 MS scan (± 1 sec.) allowing to determine the
pep=de masses within a certain =me slot, followed by an MS/MS scan on three
to eight selected (usually most intense) pep=de (total ± 5 sec.). Total = 1 duty
cycle.
§ Now: ms
§ More sensi=ve
§ You will pick up more pep=des for one protein-> reliability of the
iden=fica=on increases dras=cally
o If sample is very complex: several pep=des reside within one chromatographic
peak and cannot always be detected and sequenced by the mass spectrometer
(peak satura=on).
§ To reduce the peak satura=on, we can tell the MS that if it sees a pep=de
with a m/z value of 837,5 don’t select it because it comes for example
of kera=n
-> Therefore, exclusion lists, containing pep=des that can be neglected (no
MS/MS scan), can be entered into the mass spectrometer.
- Usually: reverse phase chromatography at micro or capillary scale. If chromatographic
flow (5-1000 µl/min) is too high for the mass spec (=ll 500 nl/min.) a ‘spli5er’ (part to
waster and part to ESI source) is used
o Nanoscale is for the analy=cal scale
- Nanopumps with a reproducible linear speed =ll ± 50 nl/min. are also available.
o Nano scale has several advantages:
§ Lower flow rates (see above) are similar to these from ESI source, hence no
spli5er needed and less sample and solvent go to the waste.
§ Nano column can be used as ionisa=on source
§ Increased sensi=vity since the volume solvent per =me unit is reduced,
allowing the sample to concentrate.
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