1-2 MUTATIEDETECTIE
INLEIDING
Oorzaken van (erfelijke) aandoeningen
Verstoring normale biologische proces tgv: Afwijking op DNA niveau
- abnormale hoeveelheid eiwit (te veel/weinig) - chromosomale afwijkingen (numeriek/structureel)
- verandering van functie eiwit - deletie / insertie /herrangschikking
- verstoring expressiepatroon eiwit - puntmutatie
- dynamische mutatie (repeat-expansie)
Chromosomale afwijkingen komen voor bij: spontane miskraam, aangeboren afwijkingen, fertiliteitsproblemen,
kanker, gezonde individuen (kleine deleties, duplicaties, gebalanceerde translocaties)
Klinische indicaties voor onderzoek: vroege groei- & ontwikkelingsproblemen, doodgeboorte & neonataal
overlijden, fertiliteitsproblemen, structurele karakteristatie van genomische afwijking & segretatie, neoplasie,
zwangerschap
CYTOGENTISCHE TECHNIEKEN
Cytogenetica = studie van chromosomen & afwijkingen hieraan
CONVENTIONEEL CHROMOSOMENONDERZOEK (KARYOTYPERING)
Doel: opstellen van karyogram numerieke & grote structurele chromosoomafwijkingen
1) Celcultuur: groeifactoren/mitogenen toegevoegd
2) Oogsten: blokkeren in metafase, fixatie
3) Spreiden op objectglaasje
4) Kleuring specifiek bandenpatroon per chromosoom
5) Metafase selecteren onder LM
6) Karyogram (door computergestuurde beeldanalyse) sortering volgens grootte & centromeerpositie
- Metacentrisch: p-arm ≈ q-arm & centromeer centraal Ch1-3
- Submetacentrisch: p-arm < q-arm Ch4-12, 16-20
- Acrocentrisch: geen p-arm Ch13-15, 21, 22
Numerieke afwijkingen: + / –
Structurele afwijkingen:
Gebalanceerd Notatie
Geen netto verlies/winst chromosomaal materiaal
- Reciproke translocatie: segmenten uitgewisseld t(chr1;chr2)(breukpuntchr1;breukpuntchr2)
- Robertsoniaanse translocatie: fusie tussen q-armen van rob(chr1;chr2)(q10;q10)
acrocentrische chromosomen verlies p-armen
- Inversie: paracentrisch / pericentrisch inv(chr)(breukpunt1breukpunt2)
, Ongebalanceerd Notatie
Netto verlies/winst chromosomaal materiaal
- Deletie: terminaal / interstitieel del(chr)(breukpunt)
- Duplicatie dup(chr)(breukpunt1breukpunt2)
- Marker chromosomen: kleine niet-geïdentificeerde chr +mar
- Ringchromosomen r(chr)(breukpunt1breukpunt2)
- Isochromosoom: 2x dezelfde arm, verlies andere arm i(chr)(p10) of i(chr)(q10)
Voordelen Nadelen
- Genoomwijde analyse - Nood aan delende cellen
- Opsporen van gebalanceerde & niet- - Beperkte resolutie = kleinst waarneembare afwijking
gebalanceerde afwijkingen - Tijdrovend (arbeidsintensief)
- Relatief eenvoudig - Sterk visueel gebaseerd
FLUORESCENTE IN SITU HYBRIDISATIE (FISH)
Doel: deletie, duplicatie, herrangschikking detecteren
Fluorescent gelabelde DNA probe gehybridiseerd met metafase/interfase chromosomen
visualisatie onder fluorescentiemicrosoop (normaal bindt probe aan 2 chromosoomsegmenten)
Probes:
- Genspecifieke / locus-specifieke probes: detectie specifiek deletie / duplicatie
- Repetitieve DNA probes: detectie repetitieve DNA elementen (bv. telomeren, centromeer)
- Paint probes: mix van probes die hele chromosoom aankleuren herrangschikking detecteren
0) (niet-)delende cellen op objectglaasje gespreid
1) Denaturatie: DNA & probe enkelstrengig maken
2) Hybridisatie: probes & DNA binden
3) Post-hybridisatiewasstappen: niet-specifiek gebonden probes verwijderen
4) Detectie: fluorescentiemicroscoop
Voordelen Nadelen
- Hoog resolutievermogen - Genoomnauwe analyse: vermoeden van diagnose nodig
- Kortere tijd - Geen gebalanceerde afwijkingen
- Kan op delende & niet-delende cellen
INDICATIES VOOR CYTOGENETISCH ONDERZOEK
Diagnostische oppuntstelling bij verschillende fenotypes: fertiliteitsproblemen, familiale voorgeschiedenis,
neoplasie, numerieke chromosoomafwijkingen, trisomie karakterisatie, ouders van kind/foetus met
chromosoomafwijking, opvolging van afwijking gedetecteerd met bv. micro-array
,ARRAY TECHNOLOGIE
Micro-array
Doel: deleties, duplicaties, expressie
Voordelen Nadelen
- Hoog resolutievermogen - Geen gebalanceerde afwijkingen
- Genoomwijde analyse - Lage mozaïeken kunnen gemist worden
- Geen cellen in kweek te brengen
ARRAY-CGH
CGH = comparative genomic hybridisation
Chip geanalyseerd door computer:
intensiteit van fluorescente labels bepaald
hoeveelheid DNA thv elke probe
berekend door vergelijking tov referentie
Enkel informatie over aantal kopieën
SNP-ARRAY
SNP = single nucleotide polymorphism
EENVOUDIGE SNP ARRAY
Chip met miljoenen probes verspreid over hele genoom probedistributie zodanig dat hogere concentratie
probes uit regio met gekende ziektegenen / variabele regio’s geassocieerd zijn met ziektebeelden
0) DNA geamplificeerd
1) DNA gehybridiseerd op probes van de chip
2) Probe met 1 gelabelde nucleotide verlengd, complementair aan SNP
3) DNA weggewassen, ingebouwde nucleotides fluorescent gelabeld
4) Laser scant & bepaald welke nucleotide ingebouwd werd
5) Plot gemaakt per chromosoom (intensiteit: deletie/duplicatie)
Informatie over aantal kopieën & over genotype op die plaatsen
, METHYLATIE SNP-ARRAY
Doel: bepalen van methylatiestatus op bepaalde positie
Bisulfietconversie: ongemethyleerde cytosines omgezet naar uracil ; gemethyleerde cytosines niet
Voordelen tov array-CGH
- Kan parentale oorsprong van CNV (copy number variaties) achterhalen
- Kan triploïdie detecteren
- Kan Uniparentale Disomie (UPD) detecteren
CLASSIFICATIE VAN CNV’S
Indicaties voor CNV om pathogeen te zijn Indicatie voor CNV om niet-pathogeen te zijn:
- Enkel voorkomen van CNV bij meerdere - CNV met hoge frequentie in onaangetroffen bevolking
patiënten met zelfde fenotype - CNV overgeërfd van gezonde ouders
- Grotere CNV (omvat meer genen)
- De novo CNV
Categorieën van pathogene CNV’s
CNV ligt aan basis van ziekte met volledige penetrantie
CNV geeft verhoogd risico op bepaalde ziekte = susceptibility CNV
CNV is recessief ziekte-allel
INDICATIES VOOR ARRAY ONDERZOEK
Indicaties voor cytogenetisch onderzoek + …
Vermoeden ongebalanceerde afwijkingen, vermoeden van chromosomaal defect, afbakening van
deleties/duplicaties, UPD onderzoek, bepaling parentale origine van de novo structurele afwijkingen,
homozygoziteitsmapping
MOLECULAIRE TECHNIEKEN
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Specifieke allelen, repeatexpansies op niveau van individuele base
- Voor directe analyse van geamplificeerde fragment
- Om bepaald DNA-fragment te amplificeren om voldoende materiaal te hebben voor verdere analyse
Cyclisch proces: 30-35x herhaald
1) Denaturatie (90°C): enkelstrengig DNA
2) Annealing (50-65°C): DNA-primers hybridiseren aan DNA
3) Elongatie (72°C): complementaire streng gehybridiseerd (met dNTP’s) door DNA-polymerase
