DNA vs. RNA
DNA = deoxyribonucleic acid
RNA = ribonucleic acid
1. DNA -> dubbelstrengig, RNA -> enkelstrengig
2. RNA is korter
3. DNA -> thymine, RNA -> uracil
4. DNA -> 3’OH uiteinde, RNA -> 2’OH uiteinde (zeer vatbaar voor RNasen)
Dideoxyribosen (ddNTPs) -> Sanger sequentie -> stoppen van ketenverlenging
Soorten RNA
mRNA, tRNA en rRNA; paradigma coderend RNA
(replicatie) DNA (transcriptie) -> RNA (translatie) -> proteïne
coderend en niet-coderend RNA
mRNA = coderend
tRNA en rRNA = niet-coderend
- mRNA = 1-4% van het totale RNA gewicht
- rRNA = 80-95% van het totale RNA gewicht
- short ncRNAs = <200 nucleotiden lang
- IncRNA = >200 nucleotiden lang
Structuur van mRNA
5’cap – (transcriptie start) - 5’UTR – start codon - coding region – stop codon - 3’UTR –
polyAstaart
Transcriptie start = promotor
5’cap = gemodificeerde guanine (methylgroep en dubbele fosfaatbrug)
1. DNA -> pre-mRNA (via transcriptie)
pre-mRNA = bevat 5’cap + introns + exons + polyAstaart
2. Pre-mRNA -> mRNA (via RNA processing = introns weghalen)
mRNA = bevat 5’ cap + exons + polyAstaart
3. mRNA -> polypeptide (via translatie)
RNA voorzorgen en bewaren
Voorzorgen bij staalname, werken met en bewaren van RNA
Problemen:
- RNA profiel -> veranderd na staalname (bv. inductie genen)
- RNA degradatie -> RNasen (endogeen en exogeen zijn)
1
, - DNA contaminatie -> scheiding van DNA/RNA = onvolledig
Staalname:
1. Anticoagulans kiezen: best EDTA -> heparine inhibeert DNA en RNA reacties
2. Stabiliseren van RNA: RNA degradatie/inductie voorkomen
onmiddellijk verwerken of invriezen in vloeibaar stikstof (-196°)
bloed RNA: vacuümtube met RNA bewaarmiddel (bv. PAXgene tube)
cellen/weefsels RNA: RNA bewaarmiddel (bv. RNAlater = ammoniumsulfaat oplossing
die eiwitten precipiteert -> verwijderen voor extractie, of Trizol = eerste stap van extractie)
DNA zal onveranderd blijven tijdens staalname = stabieler. DNA is gemakkelijk vrij van RNA
te maken door RNasen toe te voegen.
Staalverwerking
RNasen vrij werken!
- Zuiver werken
- Labojas en handschoenen -> bescherming stalen
- Labo/bench-zone voor RNA werk
- Oppervlakte en pipetten -> RNasen schoonmaakproduct (bv. RNasen ZAP)
- Filter pipettips
- Nuclease-vrije oplossingen en water
o Gefilterd water (milli-Q), RT-PCR grade water (getest op RNasen)
o Behandeling met RNasen inhibitoren
▪ DEPC (carcinogeen!) = reageert met amines in az (vnl. histidine) in de
katalytische site van RNasen en inhibeert deze. (Tris = amine; DEPC
werkt niet in Trisbuffer)
▪ Nieuwere RNasen inhibitoren zijn minder carcinogeen
Bewaring
- RNasen vrij water of TE-buffer 10/1, maar EDTA inhibeert RNasen niet: enkel DNasen
- Bewaring tot 1 jaar op -80° (< dan bewering DNA)
- Als alcoholprecipitaat > bewaring
- Meerdere aliquots staal in RNA bewaarmiddel voor latere RNA extractie beweren =
BETER
DNA contaminatie
- Niet altijd een probleem; als er onderscheid gemaakt wordt tussen DNA en RNA bij
een proef
- DETECTEREN;
o RT-min controle
o Elektroforese
- VERWIJDEREN; DNasen behandeling
o Toevoegen tijdens RNA extractie of behandeling van al geëxtraheerd RNA
o DNAsel ( knipt dsDNA en ssDNA) of dsDNA-specifieke DNasen
o NADEEL: verlies/degradatie van RNA is mogelijk
2
,RNA extractie is moeilijk DNA vrij te krijgen
RNA extraheren
Staal -> lyseren -> isoleren -> concentreren
Methode = afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriën en virussen)
en afhankelijk van het doel (hoeveel nodig, kwaliteit, …)
Essentiële stappen
1. Lyseren; weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt, lysaat = vloeistof met inhoud van
gelyseerde cellen, goede homogenisatie belangrijk
2. Isoleren; RNA uit het lysaat halen en opzuiveren
3. Concentreren; RNA in het gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen en
concentreren
Afbraak, lysis en homogenisatie van weefsels/cellen
- Verschillende methoden afh. van weefsel en celtype, volume en aantal stalen,
moleculen en toepassing.
- Remmers toegevoegd van niet-gewenste moleculen (DNasen en RNasen en
proteasen)
- Detergenten (bv. SDS, Trizol, guanidium chloride) = meest gebruikt
- Vriezen en ontdooien; lyseert i.t.t. cryopreservatie om cellen intact/leefbaar te
houden
- Mechanische homogenisatie; pletten in vloeibare stikstof (mortier en Pestel), bead-
gebaseerde homogenisator en schudden aan een hoge snelheid.
- Vloeibare homogenisator; Douncer = oplossing tussen glazen pestels
VOORDEEL = mild, laat celorganellen intact
- Sonicatie; gebruikt voor gewenste DNA fragmentatie
NADEEL = kan ook DNA/RNA fragmenteren
RNA extractie met organische solventen -> TRIZOL
Trizol = zuur PH 4-5 (guanidium thiocyanaat, fenol en chloroform)
- Guanidium thiocyanaat: cel lysis + RNase inhibitor
- VOORDEEL= goedkoop, eenvoudig, goede opbrengst en zuiverheid
Toevoegen -> goed mengen -> RNA is gescheiden van DNA en eiwitten -> waterlaag met RNA
overbrengen in een nieuwe tube -> gevolgd door alcoholprecipitatie of kolomchromatografie
Vergelijking met DNA extractie
DNA: phenol – chloroform PH7 voor DNA extractie
RNA: Trizol PH 4-5 voor RNA extractie
Verschil in PH en lading zorgt voor scheiding van DNA en RNA
RNA in de waterlaag
DNA in de waterlaag of organische laag/interfase
3
, 1. Alcoholprecipitatie
Uit supernatans
principe: DNA en RNA (PO3- groep) -> precipiteert in de aanwezigheid van zout + alcohol,
DNA + RNA lost terug op in water/buffer
Zouten: natriumacetaat
Alcoholen: ethanol of isopropanol
Bij lage concentraties en bij lage temperaturen! OF een drager toevoegen (glycogeen)
DNA fosfaatgroep is – geladen (hydrofiel), wanneer – lading geneutraliseerd wordt
door een + lading wordt dit hydrofoob.
Eiwitten slaan al neer met zout in een waterige oplossing voor DNA moet alcohol
toegevoegd worden.
2. Kolomchromatografie
Principe:
selectieve binding van RNA -> bepaalde condities van zout + pH (andere condities zetten
RNA terug vrij = elutie)
Vloeistof gaat door de silica kolom o.b.v.:
- Centrifuge
- Zwaartekracht
- Vacuüm
Verschillende type kolommen:
- VOORDEEL = eenvoudig en zeer goede zuiverheid
- NADEEL = duurder, opbrengst beperkt door capaciteit van de kolommetjes
Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magnetische beads uit
oplossing halen ; bedoeling = grote schaal, high-throughput en automatisering met
robots
vb. Covid-19 diagnostische testen
Silica kolom
- Buffer met chaotrope zouten (guanidium chloride)
o Lysis
o Nuclease inhibitie
o Chaotroop zout zorgt voor selectieve binding van RNA aan silica kolom
- Spin kolom = vloeistof door kolom sturen -> centrifugatie
- Elutie = losmaken -> water/buffer zet RNA terug vrij
RNA kwantificeren
Waarom? Inschatting opbrengst (welke hoeveelheid beschikbaar voor het experiment),
verschillende experimenten vragen een bepaalde concentratie/hoeveelheid RNA als input.
afwijkende concentraties/hoeveelheden kunnen HINDEREN:
- Te laag; weinig abundante targets indien er onvoldoende input is voor het
experiment.
- Te hoog; inhibitie of saturatie mogelijk, meer is niet altijd beter
4
