Resume
Samenvatting Moleculaire technieken Course 5 blok 1
- Cours
- Établissement
Samenvatting van alle moleculaire technieken lessen in Course 5 blok 1.
[Montrer plus]
Vendeur
S'abonner
noramfaro
Aperçu du contenu
Moleculaire technieken course 5 blok 1Week 1
PCR en primer design
PCR is een techniek die gebruikt wordt voor het amplificeren van DNA.
In blok 1 wordt PCR gebruikt voor het kloneren van een gen. Humane kankercellen bevatten
het IDH1 gen. Het mRNA wordt uit de kankercel gehaald en door middel van reverse
transcriptase wordt er cDNA gemaakt. cDNA bevat hierdoor alleen maar exonen. Om te
bepalen of de mutatie effect heeft op de enzymactiviteit moet het enzym geïsoleerd worden.
Doordat de humane kankercel maar heel weinig van het eiwit bevat is het lastig te
onderzoeken. Daarom wordt het humane gen in het bacteriële DNA geplakt. De bacterie
deelt zich heel snel waardoor er veel van het IDH1 gen aanwezig is. De plasmide wordt in
een andere bacterie geplakt, die door inductie voor eiwit expressie zorgt. Een voorbeeld van
gebruik van klonering is het maken van humaan insuline.
Het doel van PCR: het amplificeren van DNA en het toevoegen van restrictie sites.
- Denaturatie: het dubbelstrengs template DNA wordt enkelstrengs.
- Annealing: de primers binden aan het enkelstrengs DNA, waardoor er een vrij 3’-OH
einde is voor DNA polymerase.
- Elongatie: dNTP’s worden gebonden aan de nieuwe streng.
Primer design
Er wordt bij PCR een forward en reverse
primer gebruikt. De forward primer bindt aan
de 3’-5’ streng. Door rechts onderaan de
complementaire streng te binden ontstaat er
een vrij 3’-OH einde waardoor DNA
polymerase een complementair stuk kan
maken onder de strand.
,Bij de reverse primer werkt het hetzelfde maar dan andersom. Let bij het schrijven van de
primers op dat beiden geschreven moeten worden van 5’-3’.
Oefenopdrachten in de powerpoint.
Vereisten voor een goede primer design
- Forward en reverse primer wijzen met de 3’ einden naar elkaar toe.
- Primers zijn 18 tot 24 nucleotiden lang.
- GC content is ongeveer 50-60%.
- Het 3’ einde moet een G of C bevatten.
- Er zijn geen complementaire sequenties binnen de primer (hairpin).
- De primers zijn niet complementair aan elkaar (primer dimers).
- Het verschil in annealing temperatuur is maximaal 5 graden.
Primers komen niet buiten de coderende sequentie.
Annealing temperaturen
Te hoog: Primers kunnen niet binden. Hierdoor is er geen product.
Te laag: Primers hebben aspecifieke binding. Dit zorgt voor incorrecte producten en primer
dimers.
Te ver uit elkaar: Maar één van de twee primers kan binden. Hierdoor ontstaat er
enkelstrengs DNA.
Vermijd bij het ontwerpen van een primer stukken sequentie met veel AT/GC. Hierdoor zal
de primer niet specifiek bij één basenpaar binden.
Bepalen van de elongatie tijd
Taq DNA polymerase heeft een snelheid van 1 kB/min.
Gradiënt PCR: techniek waarbij de optimale annealing temperatuur
voor een primerset wordt bepaald. Elke cyclus heeft een andere,
oplopende temperatuur. Op de gel zal duidelijk zijn welke temperatuur
optimaal is voor de primers.
Touchdown PCR: techniek waarbij aspecifieke binding
geminimaliseerd wordt. De annealingstemperatuur wordt bij elke
cyclus lager. Uit de gel zal duidelijk worden welke temperatuur de
meest specifieke producten geeft. Dit product bestaat alleen uit de
target sequentie, en bevat geen primer dimers.
Kolonie PCR: techniek waarbij een bacteriële kolonie wordt
toegevoegd als DNA template. Hierdoor kan bepaald
worden of de kolonie een plasmide bevat. Bij de
denaturatie stap lyseren de cellen en komt het DNA vrij. In
de praktijk wordt kolonie PCR gebruikt om te bepalen of de
E. coli TOP10 en BL21(DE3) cellen het recombinant DNA
bevatten. Voor dit type PCR is geen proofreading nodig.
, Week 2
Clonerings vector: klein DNA molecuul. Van een virus, plasmide of ander organisme, dat
stabiel onderhouden kan worden in een ander organisme en waar een vreemd DNA
fragment in gezet kan worden.
Standaard onderdelen van een vector:
- antibiotica resistentie gen. Bijvoorbeeld AMP/BLA: een resistentie gen tegen
ampicilline of beta-lactam. Door het resistentie gen blijft de plasmide in de host cel.
De plasmide is essentieel voor de overleving van de cel, als de cel zich in een
medium met antibiotica bevindt.
- ORI: origin of replication. Het startpunt voor de replicatie van de plasmide. Circulair
DNA heeft maar één ORI.
- MCS/Polylinker: de plek waar het insert in de plasmide wordt gezet. De MCS bevat
verschillende restrictie sites. Dit zijn de plekken waar restrictie enzymen kunnen
knippen. Verschillende restrictie sites zijn van belang omdat het insert DNA van
zichzelf ook een restrictie site in de sequentie heeft zitten. De enzymen zouden dan
in het insert DNA knippen. Doordat er verschillende restrictie sites zijn, kunnen
verschillende enzymen gekozen worden.
Restrictie enzymen: dimeer enzym. Knipt het DNA op twee plekken
door waardoor het een dubbelstrengsbreuk is.
Blunt ends: Het dubbelstrengs DNA wordt recht doorgeknipt. Er
steekt niets uit.
Sticky ends: Het restrictie enzym knipt het DNA op verschillende
plekken in de restrictie site. Hierdoor ontstaat er een overhang. Deze
overhang is essentieel bij klonering omdat het insert op die manier in
de vector kan knippen.
5’ overhang: 5’ kant is langer.
3’ overhang: 3’ kant is langer.
De restrictie enzymen knippen zowel de plasmide als de insert. Hierbij ontstaat er een gat in
de plasmide waar het insert precies in past.
Hoe maak je een PCR product dat in een MCS kan worden gekloneerd?
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur noramfaro. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €6,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
80796 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans