1. Doel
- Weefsels + organen observeerbaar maken voor LM of EM
- LM kleur
- EM zwart-wit
2. Problemen
- Weinig contrast in biologisch materiaal kleur nodig
- Weinig licht( = elektronen) doorlatend te dik
3. Methodes
3.1 Fixatie
- Bewaren van weefsel met behoud van oorspronkelijke structuur = denatureren van eiwitten =
3D structuur gaat verloren stilleggen van bacteriële en autolytische afbraakreacties
o Anders zou het weefsel rotten
- Permeabiliseren van celmembraan gaten in membraan maken zodat kleurstof en
chemische fixatie erin kan
o Soms wordt het membraan daardoor vloeibaar
- Maakt weefsel harder + poreuzer
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, o Nodig zodat je dunnen coupes kunt snijden
- Soorten fixatie
o Chemische fixatie
Immersie = onderdompelen
Perfusie = in bloedvaten spuiten
Alcoholen
Ethanol eiwitten doen neerslaan + ze worden onoplosbaar =
precipiterend fixatief
Glutaaraldehyde, formaldehyde eiwitten gaan crosslinken=
crosslinkende fixatief eiwitten zitten aan elkaar vast dus werking
wordt stilgelegd
Andere: azijnzuur, osmium tetroxide
o Koude fixatie
Invriezen van weefsel
Gaat sneller maar minder dunnen coupes
- Artefacten verandering die tijdens de fixatie ontstaan in een weefsel en dus afwijken van
de in vivo situatie
- Hoe groter het weefsel hoe langer het in het fixatief moet zitten
3.2 Inbedden
- Inbedmiddel
o Substantie die in weefsel dringt
o Moet eerst vloeibaar zijn en dan hard
o Materiaal snijdbaar in dunne coupes
o Bv paraffine/ kaarsvet , hars, plastics
Verharden door polymerisatie
o Zijn hydrofoob eerst weefsel dehydrateren
Breng weefsel telkens in ethanol met stapsgewijs met een stijgende
concentratie: 30° 50° 70° 90°
- Clearing
o Gebeurd in tolueen bindt zowel met ethanol als het inbedmiddel
- Infiltratie weefsel wordt geplaatst in het vloeibaar inbedmiddel
- Inbedden verharden van inbedmiddel in weefsel
- Trimmen wegsnijden van inbedmiddel zodat je mooie coupes kunt maken
3.3 Snijden
- Dankzij hardheid van het inbedmiddel kun je het weefsel in dunne coupes snijden
- Microtoom= apparaat waarmee je de coupes kunt snijden
- Paraffine
o 1-20µm 5µm
o Doorlaatbaar voor licht LM
o Microtoom met stalen mes
- Hars & plastics harder dan paraffine
o 50 nm – 2µm: half dunne coupes
LM
Microtoom met glazen mes
Meer details
o 60- 100 nm 70 nm
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