Resume
samenvatting moleculaire biologie en DNA-technologie
- Établissement
- Hogeschool Gent (HoGent)
samenvatting moleculaire biologie en DNA-technologie 2de jaar, 1ste semester
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
Moleculaire biologie en DNA-technologieHoofdstuk 1: isolatie van nucleïnezuren
1. Structuur DNA
DNA bestaat uit:
2 antiparallelle strengen; gebonden door H-bruggen
Een 5’ uiteinde met een fosfaatgroep
Een 3’ uiteinde met een OH-groep
Bestaat uit 4 verschillende nucleïnezuren: A, G, T en C
2. Structuur RNA
= zelfde primaire structuur als DNA maar heeft een OH op 2’
Reactiever en minder stabiel dan DNA
RNA kan secundaire structuren vormen door lussen/loops te maken
(bv. Hairpin)
Waarom isolatie DNA nodig?
Enzymwerking wordt verstoord bij onzuiver DNA
Zuiver DNA nodig voor downstream
1. Lyseren (=stap 1); het openbreken van cellen om aan DNA te
kunnen
Methode is afhankelijk van het staaltype, er zijn meerdere soorten
weefsels en cellen die allemaal anders behandelt moeten worden
1.1 Mogelijkheden om cellen open te breken om DNA te isoleren
Chemische:
Detergent (SDS = vorming van micellen)
Alkalische buffer (NaOH)
Biologisch:
a.d.h.v enzymen; de meest voorkomende is Proteïnase K in de
humane cel
Proteïnase K Eigenschappen
= een enzym die eiwitten (in - Breed-spectrum
celmembraan en op - Knipt na hydrofobe
nucleïnezuren) en nucleasen groepen
afbreekt - Degradeert eiwitten
- Kan nucleasen
onschadelijk maken
- Verkiest 60° en pH = 7-9
,Toevoeging SDS(=detergent) of chaotrope stoffen = ze denatureren
het substraat waardoor het toegankelijker wordt voor het enzym =
activiteit
En lysozyme als enzym bij de bacteriën = hydrolyseert
peptidoglycaan
Gram positieve Gram negatieve
Dikke laag peptidoglycaan Een dunne laag peptidoglycaan
= kan makkelijker Met daarrond een extra
gehydrolyseert worden memebraan -> moeilijker te
hydrolyseren
Fysisch
Druk, temperatuur, straling
Mechanisch
Door beweging: vortexen of soniceren; met geluidsgolven
Combinatie van methodes
Bijvoorbeeld een lysebuffer = detergent en proteïnase K en een
chaotroop agens
1.2 Chaotroop agens
= (bv. SDS, ureum, fenol) verhoogt entropie in een biologisch
systeem door te interfereren met zwakken intermoleculaire krachten
zoals waterstofbruggen, vanderwaalskrachten, hydrofobe effecten=
neiging van niet polaire moleculen om samen te hangen en H2O uit
te sluiten
Functies op biomoleculen:
Verbreekt H20 mantel rond DNA
Denatureert eiwitten
Inactiveert nucleasen = bescherming DNA
Verhoogt membraanpermeabiliteit door verstoring hydrofoob
effect
(! Te kennen buffers = zie document op chamilo!)
1.3 Algemeen: hoe worden de cellen opengebroken in verschillende
organismen?
Humane cellen Bacteriën
Opengebroken door Opengebroken door NaOH
Proteïnase K + detergent + en warmte + lysozyme
warmte
, 2. Het zuiveren van het gelyseerde DNA (= stap 2)
Reden? Zuiver DNA kan beter deelnemen aan reacties
Cellysaat = de substantie verkregen na cellyse, bestaat uit:
DNA in waterige oplossing
RNA in waterige oplossing
Afbraakmaterialen van de cel
Detergenten, proteïnase K en chaotroop agens
Vroeger Nu
Fenol-chloroform extractie Kolomchromotografie of boom-
Gouden standaard extractie
maar schadelijke
producten
2.1 Fenol-chloroform extractie
Bestaat uit 3 fases
1. Waterige fase: met DNA; afzonderen + koude ethanol en
precipitatie -> pellet drogen en oplossen in neutrale
buffer
2. Interfase: met celdebris; eiwitten
3. Organische fase: met proteïnen en lipiden
De waterige fase wordt op het einde overgebracht in een
ander epje
Voordelen Nadelen
Zeer zuiver DNA Tijdrovend
Goede opbrengst Isopropanol precipitatie
Schadelijke organische
solventen
2.2 Boom extractie of kolomchromotografie
1. Lysaat wordt in een epje gedaan met een silicagel aan de
onderkant
2. Door centrifugeren blijft het DNA achter op de silicagel en de
andere contaminenten niet
Wordt gedaan met behulp van een bindingsbuffer (hoge zout
conc en chaotroop agens)
Functie
Verwijderen watermantel DNA en kolom
Vorming kationbrug tussen negatief DNA en silicakolom
3. De stoffen worden gewassen
, Wordt gedaan met ethanol en hoge zoutconcentratie + lage
pH + ethanol
=> DNA blijft aan kolom en contaminenten worden
weggewassen
4. Je verkrijgt een eluaat; door elutiebuffer: lage
zoutconcentratie en hoge pH
Voordelen Nadelen
Snel
Minder schadelijk
Zuiver en geconcentreerd
DNA
Makkelijk automatiseren
3. Het bewaren van het geïsoleerde DNA (=Stap 3)
3.1 Met een buffer
Dnase-vrij water
TE (Tris-EDTA) buffer
Voordeel: DNA langer stabiel
Nadeel: mogelijks storend voor downstream applicaties
3.2 Temperatuur
Normaal: -20°C
Bewaren voor lange periodes: -80°C
Bij herhaaldelijk in- en uitvriezen: 4°C, dit moet je proberen
vermijden want het lijdt tot vermindering van het DNA
3.3 Bewaren van startmateriaal
Je moet in- en uitvriezen vermijden van zodra het staal klaar is
3.4 Hoeveel startmateriaal?
Aan de hand van de grafiek kan je de maximale hoeveelheid van
startmateriaal afleiden
Te veel = je krijgt minder eindproduct
3.5 RNase tijdens extractie
Zorgt ervoor dat er geen RNA maar enkel DNA terecht komt in
het eluaat
(! Vragen slide 86!)
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur amber50. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €6,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
80467 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans