DEEL 1 : BIOTECHNOLOGISCHE PRODUCTIEMETHODEN
1. Biotechnologisch gebruik van genetisch ongewijzigde micro-organismen
Productie van biomassa door micro-organismen = FERMENTATIE
Kweek in een reactietank (fermentor) :
Micro-org. er in met minimaal voedingsmilieu/groeimedium
- C-bron (bv glucose) → ATP
- N-bron (bv ammonium) → aminozuren aanmaken
- Zouten en sportenelementen → belang bij optimale groei
Deze fermentoren zijn kleiner voor research maar kunnen tot duizenden liters zijn in de
industrie
Fermentatie processen
Batch proces (meest eenvoudige)
- Fermentor + groeimed. + micro-org. → fermentatie tot een gewenst punt
bereikt is (bv celdensiteit, concentratie,…)
- Inhoud van tank verwijderd en eindproduct geïsoleerd
Continue proces
- Na toevoegen micro-org. continue vers medium/nutriënten toevoegen &
reactiemengsel (micro-org. en product) wordt afgetapt
- Handig voor bv micro-org. die moeilijk groeien
Continue proces met celrecylcering
- Reactiemengsel ook afvoeren maar de cellen/micro-org. afscheiden en
recycleren
- Langere fermentatie (dagen)
,2. Recombinant DNA technologie
2.1 Inleiding
Structuur DNA en RNA
→ zie ppt (pagina 9-12)
mRNA synthese
Transcriptie = omzetting van DNA in boodschapper RNA (messenger RNA, mRNa)
Zeer selectief : in zoogdiercellen wordt slechts 1% van het DNA omgezet in mRNA
DNA afhankelijk RNA POLYMERASE enzyme bindt op een promoter en synthetiseert een RNA
streng van 5’ naar 3’ richting tot aan een stopsignaal
3 RNA polumerasen in eukaryoten
- RNA polymerase 1 : grote ribosomale RNAs
- RNA polymerase 2 : aanmaak mRNA
- RNA polymerase 3 : kleine stabiele RNAs waaronder tRNA
mRNA’s worden gedurende de aanmaak gemodificeerd aan 5’ en 3’ einde om hun te
onderscheiden van de RNAs gemaakt door de andere polymerasen en zo aan te geven dat
deze omgezet moeten worden in proteïnen.
het 5’ einde wordt ge-capped doortoevoeging van een gemethyleerd G nucleotide. Dit
gebeurt vrijwel onmiddellijk
Dit is een 5’-5’ binding. Men gaat ervan uit dat een deel van de nodige enzymen gebonden zit
op het polymerase II.
Deze 5’ cap zal een belangrijke rol spelen bij de eiwitsynthese (soort herkenning) en zou ook
het RNA beschermen tegen degradatie.
Polyadenylatie van mRNA aan 3’ einde
- Herkenning van een polyadenylatiesignaal (AAUAAA) in het transcript door specifieke
RNA-bindende eiwitten
→ stopt transcriptie
→ klieving transcript door endonuclease
- Poly A polymerase voegt een staart van ~250 A’s toe aan het 3’ einde
,2.2 Isolaties
2.2.1 Isolatie genomisch DNA
DNA isolatie met behulp van commercieel verkrijgbare DNA isolatiekits
Werkwijze
Isolatie cellen of weefsel
Lyse van cellen in een lyse-oplossing
- Bacteriën
Cellen suspenderen in buffer met lysozyme (breekt
peptidoglycaanlaag en dus celwand af) , Triton X-100 (lost
membranen op) en RNase A (breekt RNA af) (37°C, 30min)
Buffer met guanidine HCl (eiwitten denatureren) en proteinase K
(eiwitten afbreken) toevoegen (50°C , 30min)
- Gisten
Cellen suspenderen in buffer met lyticase (geen lysozyme want gwn
peptidoglycaan) , Triton X-100 en RNase A (30°C , 30min)
Buffer met guanidine HCl en proteinase K toevoegen (50°C , 30min)
- Dierlijke cellen (geen celwand)
Cellen suspenderen in buffer met Triton X-100 en RNase A (10 min
op ijs) ijs want bij openbreken cellen ku DNasen vrijkomen, we willen
dit remmen en DNA intact houden
Buffer met guanidine HCl en proteinase K toevoegen (50°C , 30min)
Binding DNA op een matrix met positief geladen diethyl aminoethyl (DEAE)
groepen (DNA is negatief geladen)
Was van DEAE-matrix met medium-zout concentraties (0,75-1M NaCl) (niet
gebonden materiaal wegspoelen)
Elutie DNA van DEAE in hoog zout (>1,25M NaCl)
Precipitatie DNA met isopropanol of ethanol (een alcohol-zout combinatie laat
DNA neerslaan, dan centrifugeren en oplossen in andere buffer bv water)
, DNA isolatie met behulp van silica membranen
Eigenschappen
Silica (siliciumoxide) gebaseerd materiaal
Selectieve adsorptie van DNA
Omgekeerde van daarnet DNA binding onder hoge zoutconcentraties
DNA elutie onder lage zoutconcentraties
Geen organische of toxische reagentia
Geen alcohol precipitatie
Binding DNA op silica
In hoge zoutconcentraties
- Een chaotroop zout (bv guanidine HCl) zal de watermantel rond silica
verstoren
- Na+ ionen vormen een zoutbrug tussen de negatief geladen silica en de
fosfaatgroepen op DNA
In lage zoutconcentraties
- Rehydratatie van de silica matrix verbreekt de binding met DNA
2.2.2 RNA isolatie
Methode 1 : extractie met organische solventen
Zure fenol/chloroform/isoamylalcohol (pH<6 anders DNA ook in waterige fase)
toevoegen aan cellysaat
Emulsie maken door vortexen
Centrifugeer tot 3 fasen
Neem waterige fase en precipiteer RNA met isopropanol
Methode 2 : solid-phase extractie met silica
Isolatie cellen of weefsel
Lyse van cellen in een lyse-oplossing (met guanidine thiocyanaat) → krachtige
RNase remmer dus inactiveert
Binding RNA op silica matrix
Wassen gebonden RNA
Elutie RNA van silica
Vaak voegt men DNasen toe zodat DNA niet gaat binden
Knelpunt bij RNA isolaties : snelle afbraak van RNA door stabiele RNases
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur Mertj. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €10,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
