- pDNA
o pDNA= cirkelvormige dubbele streng DNA
o Ligt buiten chromosomaal DNA
o Genetische info tsn bacteriën uitwisselen
o Kunnen alleen of met honderden in een cel/ bacterie zitten
o Dragen minstens 1 gen
o Kan onafhankelijk repliceren
Origin of replication
o Selectiemarker: gen dat resistentie tegen bepaald antibioticum is
- Plasmide= buiten chromosoom van eencellige organismen
o 3 belangrijke locaties
Origin of replication: replicatie start hier
Multiple cloning site (MPS): sequentie met herkenningssites voor RE
Antibiotica resistentiegen-> selectie
- Kunstmatige plasmiden
o Vaak gebruikt voor genetische modificaties uit te voeren
o Stukken DNA met gewenste eigenschappen aan cel toevoegen
o Gentherapie hiermee
o In wetenschappelijk onderzoek:
Vaak gebruikt om bepaalde structuren fluorescent te kleuren
Plasmiden met GFP (green fluorescent protein)
- Restrictie-enzymen
o Herkent specifieke DNA-sequenties → knipt DNA strengt daar doormidden
o Kunstmatig kan men een nieuw DNA stuk invoegen
o Elk restrictie-enzym → eigen specifieke nucleotidenvolgorde
o Enzym dat een specifieke DNA-sequentie herkent (recognition site) en deze doorknipt
Enzymen knippen bij verschillende plasmiden op verschillende plaatsen
Fragmenten van verschillende groottes
o M.b.v. restrictie: nieuwe genen in plasmide brengen
o 4-8 nucleotiden lang
o Je kan er plasmide mee identificeren
1 enzym knipt in verschillende plasmiden op verschillende plaatsen=> fragmenten van
verschillende groottes
=> nieuw stuk DNA kan ingevoerd w
o Hierna volgt DNA ligase: plakt het plasmide met nieuwe gen terug toe
o Bacteriën w gekweekt in een geschikt medium dat de juiste antibiotica bevat=> enkel bacteriën die
het plasmide bevatten (én het antibioticumresistentiegen) zijn in staat om te groeien
1
, Hierna w bacteriën gelyseerd om de plasmiden te isoleren, nu komt de zuivering
- Vermeerderen van pDNA in bacteriën
o Gewenst plasmide verkregen → opkweken in bacteriën
o Antibiotica rijk medium → enkel plasmiden overleven met
antibioticumresistentie
o Na groeiperiode → gelyseerd om plasmiden te isoleren
2
, DNA opzuivering
1.a Lyse van bacteriën 2. Binden van DNA aan silica-kolom 3. Wasstappen
- Om DNA te isoleren - Supernatans op silica kolom brengen - Wassen met zout/ethanol oplossing
- “lysis buffer” - Silica & DNA negatief geladen o Verwijdert onzuiverheden
o Bevat enzymen & o Stoten elkaar af Eiwitten
surfactanten - MAAR we gebruiken een oplossing Overtollige zouten
o Maken celwand bacteriën met een lage pH (veel positief geladen o pDNA nog steeds gebonden aan
kapot protonen) & hoge zoutconcentratie silica
- Inhoud komt vrij (veel positieve tegenionen, Na+)
o Negatieve lading DNA & silica
afgeschermd 4. Elutie
1.b Centrifugatie o => DNA zal binden op silica
- Elutiebuffer op kolom brengen
- Grote celresten (pellet) & o Hoge pH (weinig protonen) & lage
macromoleculen (supernatans) zoutconcentratie (weinig tegen-ionen)
gescheiden Als we niet gebruik maken van een lage pH
oplossing zal DNA niet kunnen binden op het o Negatieve lading niet meer
- (in practicum beginnen we vanaf stap 2 silica afgeschermd
met het supernatans) o pDNA komt los van de kolom
tijdens centrifugatie
- pDNA nu in het eluens (onbekende
Pellet: korrels concentratie)
Supernatans: vloeistof die na
3
het centrifugeren vrijkomt
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur jadecallebaut. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €5,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
