Resume
Samenvatting Methoden in Biomedisch onderzoek 3
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Volledige samenvatting met afbeelding van methoden in biomedisch onderzoek 3.
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
Basismethoden in het Biomedisch Onderzoek 3Analyse van DNA en genomics
DNA-sequentiebepaling
Brede toepassingen
- De novo genoom sequentiebepaling
o Ongekende genomen (nog geen referentiegenoom vh species)
o Bv Humaan Genoom project
o Nieuwe organismen (bv. Sars-CoV-2)
o Gedeeltelijk of volledig
- Resequencing
o Individuen tov referentiegenoom
o Verschillen tss individuen (SNPs): 3 miljoen vd 3 miljard basen versch
o Mutaties (ziekten)
o Construct verificatie
o Klinische toepassingen: diagnose, farmacogenetica, NIPT (niet invasieve prenatale test), …
- Sequentiebepaling als teller: aantallen DNA (of RNA) moleculen (zie RNAseq, ChIPseq,…)
De novo sequencing vd resequencing
- WGS = whole-genome sequencing
- WES = whole-exome sequencing
o = coderende sequentie
o = 1.5% van genoom
- Targeted sequencing = specifieke gewenste regio’s
- Transcriptoom: RNA → cDNA
1ste generatie sequentiebepaling
Maxam en Gilbert: chemische klieving methode
- Differentiële chemische klieving (door resctrictie-enzymen) van NZ in 4 versch reacties, gevolgd door scheiding
volgens grootte op polyacryl-amidegel en visualisatie via autoradiografie (mbv radioactieve merkers)
- Nadeel: relatief korte fragmenten, niet helemaal specifiek → sequentie niet altijd éénduidig
Sanger sequencing = synthese met dideoxy-keten terminatie
- Template/matrijs = gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt door cloneren of een specifiek fragment
dat geamplificeerd wordt met PCR
- Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met versch fluorescente label)
o Reactie loopt door na inbouwen dNTP (deoxy-nt) → aan -OH kan verder gebouwd worden
o Reactie (keten) stopt na inbouwen ddNTP (dideoxy-nt) → aan -H kan niet verder gebouwd worden
Juiste verhouding dNTPs/ddNTPs
- Scheiding strengen op gel of capillair → elektroferogram
- Beperkt tot ~500 nt, moeite met herhalingen (vnl bij G-C: hebben 3 H-bruggen → plakken erg aan elkaar)
- Voor betrouwbaarheid: best 2 aparte reacties (FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen
- Elektroferogram aflezen
o 1ste 30 bp niet afleesbaar: vaak te veel fouten
o Meestal 500-700 bp (max. tot 1000 bp) goede sequentie afleesbaar
o Software om af te lezen met kwaliteitsscores per base (Phred-score)
▪ Phred score Q = -10*log10(P) → vb: score van 10 (99% ac), 20 = 1 op 100 (99%), ev
▪ P = probabiliteit van foutieve base call
1
, o Mutatiedetectie
▪ Niet altijd even hoge pieken
▪ Sequentie-fout vs mutatie? → forward en reverse reacties ter bevestiging
Verwezenlijkingen met 1st generetion sequencing (Sanger)
- Human Genome Project (HGP)= grootste multinationale biologische project ooit (1990-2001 (draft)-2003 (final))
o Stalen: meerdere anonieme individuen
o Methode: hierarchical shotgun sequencing met Sanger methode clones in YACs, BACs, P1s, cosmiden
▪ Fragmeteren (mbv RE) en mapping (volgorde bep mbv probes)
▪ Automatische sample bereiding en sequentiebepaling door 20 centers over heel de wereld
o Nog steeds updates (verschillende ‘genome builds’)
- Human Genome sequencing (2001)
o Stalen: 5 individuen
o Methode: whole genome shotgun sequencing
o Random clones, geen mapping
- Nieuwe uitdagingen
o Volledige sequentie (telomeer tot telomeer)
o Meer genomen sequencen van meerdere species
o Meer individuele humane sequenties
o Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
o Enorme mogelijkheden voor “personalized precision medicine”
▪ Kennis van DNA volgorde en SNPs → diagnose, prognose, preventie
▪ Farmacogenomics: verklaart en voorspelt of bepaalde individuen goed/slecht reageren op GM
▪ Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen (diabetes, kanker,..)
▪ Therapie op maat, bv al bij kanker
▪ Maar ook ethische aspecten (werkgevers, verzekeringsmaatschappijen,…)
o Probleem met standaard Sanger sequencing: throughput en kosten
2de generatie sequentiebepaling: short-read next-generation sequencing
- = short-read next-generation sequencing (massief korte stukjes DNA sequencen)
- doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost → massale DNA sequentiebepaling mogelijk
- richtdoel: 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor <1000 USD (“thousand-dollar genome”)
- Ontwikkeling van nieuwe technologie met 3 pijlers:
o Parallelle detectie (Massive parallel sequencing)
▪ Cluster of polony = kopieën van een DNA template
▪ Klonale in vitro amplificatie van template (<> klassieke klonering)→ miljoenen kopieën van DNA
template per cluster
▪ Multiplexing: vele clusters tegelijk (<> 1 template/reactie)
o Miniaturisatie van reacties
o Integratie van het proces (pipeline): directe detectie (<> scheiding fragmenten via gelelectroforese)
- Verschillende commerciële platformen: zeer competitief, snelle evolutie (545/Roche, Illumina, Ion Torrent, …)
- Gebaseerd op 4 stappen: aanmaak DNA library, klonale in vitro amplificatie, sequencing/sequeniebepaling, data
analyse
Aanmaak DNA library
- Library = fragmentenbank = verzameling van te sequencen templates
- Types DNA library:
o Whole genome sequencing (WGS)
o Mate Pair libraries
o Whole exome sequencing (WES) of targeted sequencing:
aanrijking door hybridisatie aan probes (in oplossing of op array)
(zie panel A) of PCR-gebaseerd (zie panel B)
o Amplicon sequencing: PCR amplicons, bv. diagnostisch panel
o cDNA library (RNA-seq – Zie Hfst RNA)
2
, - Procedure
o Input DNA → kwaliteitscontrole (staal bereiden: DNA extraheren)
▪ Hoeveelheid en concentratie essentieel: vnl vorming adapter-dimeren
▪ Zuiverheid, bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
▪ Integriteit, bv capillaire elektroforese
o Random fragmentatie (sonicatie, nebulisatie, Dnase I,…): versch gootte en uiteinden
o End repair
▪ Blunt ends maken (T4 DNA polymerase en Klenow fragment)
▪ 5’ uiteinde fosforyleren (T4 polynucleotide kinase) = fosfaatgroep aanhechten met kinase om zo
adaptoren te kunnen aanhechten
▪ Eventueel 3’ non-template A aanhechten (Taq polymerase): proofreading
o Adapters aanhechten:
▪ Nodig voor PCR en sequencing primers + ev. indices/barcodes (per staal/molecule)
▪ Ligatie met fragment uiteinden (sticky end met 3’A overhang of blunt-end)
▪ Eventueel selectie van fragmenten met 2 versch adaptoren
▪ Enkele PCR cycli: fragment met adapters amplificeren, high-fidelity polymerasen met min
o Alternatief: tagmentatie → fragmentatie en adapters aanhechten in 1 stap
▪ Bv. in Illumina Nextera kit
▪ Transposase enzyme met dubbele activiteit: bindt op random plaatsen aan DNA → knipt en voegt
adapters toe
▪ PCR cycli met toevoeging extra barcodes aan adapters
o Size selection
o Doel: gewenste lengte inserts selecteren
o Klassiek: agarose gel-elektroforese: gewenste lengtes uitsnijden en opzuiveren met alcoholprecipitatie of
ionenuitwisselingskolom
o Nieuwere selectie-methodes: magnetische beads binden DNA, verhouding DNA/beads bepaalt gebonden
lengte
• 1-zijdig: korte fragmenten zoals adapter-dimeren wegfilteren
• 2-zijdig: wegfilteren kleine en grote fragmenten
Magnetische beads gaan DNA binden → DNA kan gecapteerd worden mbv magneten
o Kwaliteitscontrole
▪ doel: gewenste lengte en C inserts controleren, gewenste verhouding voor poolen van libraries
bep
▪ capillaire elektroferose bv Agilent Bio-analyer
Klonale in vitro amplificatie
- Doel: simultane, maar gescheiden, amplificatie van miljoenen fragmenten
- Verschillende methoden om scheiding tss clusters te behouden (vaste fase = solid-phase, emulsie, oplossing)
- Emulsie PCR (bv. 454, IonTorrent)
o Beads met oligonucleotiden complementair aan adaptoren
o 1 fragment laten binden per bead
o PCR reagentia toevoegen
o Olie-emulsie maken → duizenden aparte reacties in 1 buisje
o On--bead amplificatie via PCR
3
, 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule gebonden op een bead
- Solid-phase bridge amplificatie (bv. Illumina)
o Vast opp met oligonucleotiden complementair aan de adptoren
o Fragmenten vormen lokaal bruggetjes via brownse beweging
o PCR
clusters (polonies) = 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule op een 1-2 μm spot
- Solid-phase template walking ‘wildfire’ (bv. SOLiD)
o Opp met oligo’s complementair aan adaptoren
o Fragmenten laten binden
o Partiële denaturatie → vrije uiteinden ‘wandelen’ lokaal
o Amplificatie
1000den lokale clusters
- Rolling-circle amplificatie in oplossing (bv. Complete Genomics)
o Eerste van 4 adaptoren (rood) ligeren aan fragment dat men wil amplificeren
o Circulair DNA template maken via ligatie
o RE knippen downstream met type III endonuclease (bindt op een specifieke plek en knippen stukje
verder, type II knipt op plek van binding)
o 2e set adaptoren ligeren, circiuariseren en knippen → bindingsplaats voor nieuwe adaptoren → 2x herh
o Rolling circle amplificatie
o Clusters = nanoballs = concatemeren (lange DNA moleculen met meerdere kopieën van template na
elkaar)
o Hybridiseren op vaste drager
Sequencing van clusters/sequentiebepaling
- Sequencing-by-synthesis met reversible chain terminators (Illumina en GeneReader)
o Reversible chain terminators: fluorescent gemerkte nt dat een
terminatorketen heeft → 1 per keer inbouwen → aflezen stopt → adh van
kleur weet men welke nt is ingebouwd
o Terminatorgroep en fluorescente groep eraf gooien → opnieuw mengsel
van terminator-nt toevoegen
o Mog om miljoenen sequenties tegelijk te meten
4
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur AnetteVDB. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €8,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
78998 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans