Hoofdstuk 2-7 Enzymkinetiek en enzymmechanismen gegeven door Prof. D. Wim Versees. Interessant vakje! Ondanks dat dit documentje veel komma's bevat, kan het je een grote onderscheiding opleveren. Succes xoxo
Chapter 2 – Steady-State Enzyme Kinetics
Inhoud:
2.1. Historical perspective
2.2. The Michaelis Menten (MM) equation
2.2.1. The equilibrium assumption (MM treatment)
2.2.2. The steady state assumption (Briggs-Haldane treatment)
2.2.3. Intermediates occurring after EA (minimal realistic model)
2.3. Significance of MM parameters
2.4. Graphs of the MM equation
2.4.1. Plotting v in function of a
2.4.2. Lineweaver Burk
2.4.3. Hanes plot
2.4.4. Eady-Hofstee plot
2.4.5. Cornish-Bowden plot
2.5. Experimental design
2.6. The integrated MM equation
2.7. Reversible reactions – Haldane relationship
2.8. Derivation of rate equations
2.8.1. Method of net rate constants and transit times
2.8.2. Method of King and Altman
2.1. Historical perspective
De snelheden v enzyme-gekatalyseerde reacties werden voor het eerst bestudeerd eind 19e eeuw. Op
dat moment wisten ze nog niet dat een enzym een eiwit was aldus was hun manier v werken primitief
en buffers waren op dat moment nog niet bekend, aldus werd er geen pH gecontrolleerd (concept pH
ontstond pas in 1909).
Meeste vdeze vroege studies werkten op enzymen afkomstig v fermentatieprocessen (openbreken v
gistcellen(cellysaten) – cytoplasma werd toegevoegd aan bepaald substraat en mn keek wat er
gebeurde.
In 1890 werkten O’Sullivan en Thompson op invertase (sucrose + water => glucose + fructose). Wat
hadden ze gezien?
- Hoe meer enzym, hoe sneller de reactie
- Hoe hoger sucrose conc, hoe sneller de reactie (ze zagen een rechte met lichte deviaties)
We wisten al lang dat A + B ® C met een v = k.A.B en als je v plot in functie v A of B dan zou
je een lineaire rechte krijgen.
Ze dachten dus ook dat ze op dezelfde manier voor E + S ® P een v gingen krijgen = k.E.P,
namelijk een rechte, echter kwam dit overeen met wat ze zagen, namelijk een lineaire rechte.
- Reactie gebeurde bij optimale T en mn zag dat Toptimaal verschoof naarmate je S toevoegt, ttz
in de aanwezigheid v S zal invertase een T verdragen dat 25°C hoger ligt dan in de afwezigheid
v S => er w dus iets gestabiliseerd (nu weten we dat dat je S is dat bindt op je enzym).
Een paar jaar later zag Brown echter wel duidelijke deviaties indien v uitgezet werd in functie v S, ttz
bij hogere concentratie v S zag mn een afbuiging vd lineariteit en zagen ze dat de snelheid
onafhankelijk werd van S.
Op dat moment wisten ze dat ze voor enzymen op zoek moesten gaan naar een ander
werkingsmechanisme.
1
,Vervolgens had je Henri die als eerste een mechanisme had voorgeschoteld waarbij E en S moesten
binden ter vorming van product en ook kwam hij tt de juiste snelheidsvgl.
Volk was nog niet rijp genoeg + Henri had wat pech met zijn metingen aangezien hij zijn metingen niet
kon uitvoeren bij stabiele pH aangezien dat nog niet ontdekt was + hij werkte niet met initial rate
methode => ttz Henri kreeg zijn eer niet omdat zijn data dus niet zo convincing was om zijn hypothese
te ondersteunen.
10 jaar later kwamen Michaelis en Menten op de markt. Ze hebben Henri zijn exp uitgevoerd bij
constante pH en initial rate condities => kwamen op dezelfde conclusie als Henri.
Nu moeten we snelheidsvgl’n afleiden voor dit mechanisme:
2.2. The MM equation
2.2.1. The equilibrium assumption: MM treatment
Ter herinnering:
- k2 en k-1 => 1e orde snelheidsconstante (1/s)
- k1 => 2e orde snelheidsconstante (1/Ms)
We hebben dus snelheidsvgl maar we kennen x niet (conc intermediair).
We schrijven dus x ifv tijd.
Stelsel v 2 vergelijkingen => geen analytische oplossing (wel numeriek maar dat bestond op dat
moment niet, bovendien iedereen houdt wel van een analytische oplossing waarop je een curve kan
fitten right). Dus om hieraan te voldoen ging men vereenvoudigingen maken:
2
,Door k2<<<k-1 te veronderstellen kan je de 2 stappen ontkoppelen van elkaar, maw heel snel EA
vormen en af en toe krijg je dissociatie van E en P. Je kan dus eerste stap als een klassieke bindingsstap
beschouwen en thus een dissociatiebindingsconstante definiëren (Ks – Kd vh substraat).
Vervolgens kunnen we de massabalans bepalen waar we e0 = e + x (totale conc v enzym is conc v vrij
enzym + conc v enzym gebonden met substraat). Hierdoor krijg je een uitdrukking voor x en deze dan
vervolgens invullen in de effectieve snelheidsvergelijking. We krijgen een snelheidsvergelijking in
functie van a en e (waar we ook naar opzoek waren).
Al een jaar later deden Slyke en Cullen studies op urease (ipv invertase) en stelden ze volgende
mechanisme voor:
We zien dus dat dit vdezelfde vorm is als MM met verschil dat je microscopische parameters hebt.
Dus dit waren de modellen die toen ontwikkeld waren en je ziet dus een r.e. verband tussen v en e,
maar je ziet dat a zowel in teller als noemer staat waardoor je geen rechte maar hyperbool verkrijgt.
2.2.2. The steady state assumption: Briggs-Haldane treatment
Naast de equilibrium assumption van MM heb je ook de steady
state assumption van Briggs-Haldane. Briggs en Haldane
onderzoekten een meer algemeen mechanismen waarbij geen
assumpties werden gemaakt over k-1 en k2. Als je in condities
werkt waarbij substraatconc >>> enzymconcentratie, dat
steady state bereikt wordt (concentratie van intermediair is
constant omdat er evenveel product gevormd wordt als
substraat verbruikt wordt.).
Besef wel dat evenwicht ≠ steady-state! Verschil?
Evenwicht? Evensnel v A naar B als omgekeerd.
Steady state? Evensnel v A naar B als v B naar C gaat. Je krijgt
in het begin opbouw v B maar op bepaald moment gebeurt de
synthese en afbraak even snel.
3
, Dus eerst heb je een pre-steady state fase waarbij je opbouw krijgt van EA complex. Na enige tijd
zullen de concentraties van alle enzymspecies constant blijven tot substraat gedepleteerd w (steady-
state conditie).
SS condities zorgen ervoor dat de differentiaalvergelijkingen omgezet kunnen worden naar klassieke
vergelijkingen.
Teller en N delen door k1 en dan krijg je
algemene vorm zoals MM voorstelde.
k-1 en k2 zijn beide eerste orde snelhconst
dus die mag je optellen. Dus als je ooit
vergeet welke k's weer vanboven staan,
het zijn de eerste orde ones.
Door wat samen te nemen krijg je de
klassieke MM vergelijking. Invulling v kcat
en KM is enkel geldig voor dit mech. Zodra
mech complexer w, zal de algemene
uitdrukking nog steeds gelden, maar die
laatste vgl niet. Maw Km en kcat w
complexer naarmate mechanisme
complexer w. M in eer v MM btw
Ok hoe stellen we zo een curve op id praktijk?
Voor aantal S conc, meet mn systeem => deze aantal punten kunnen we fitten op MM equation.
Probleem? E en S mengen? S w direct verbruikt! Je wil bv exp doen bij 1 M S => op moment dat je E
toevoegt, dan verdwijnt S (vervelend want je wil de S concentratie constant houden). Omwille v deze
reden gaan we werken onder initial rates condities.
We zien hoeveelheid product gevormd ifv tijd. Indien v constant is zou mn een rechte verkrijgen (v =
dp/dt). In realiteit krijg je dus geen rechte omwille dat S verbruikt w en snelheid thus gaat dalen (want
hoe kleiner S, hoe trager de reactie).
Dus E+S? dan meet je productvorming ifv tijd en dan moet je de rico nemen v die curve en deze
extrapoleren naar 0 omdat dat het punt is waar S conc het hoogst is (en thus niet verbruikt is)
S = S0 (of a = a0) en dus kan MM vergelijking anders genoteerd w:
4
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur sarahvanvolsem. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €18,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
