Resume
Samenvatting Methoden 2 - deel 4 eiwitten
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Methoden 2 - deel 4 eiwitten
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
2.4 EiwittenIsoleren van eiwitten
Homogenisatie dmv homogenisatiebuffer + verdere opzuivering (vaak)
Startmateriaal (staal) → ruw eiwitlysaat
Opbouw homogenisatiebuffer
• pH buffer bv Tris (pHbuffer = 7,5 = pHcel) <> bij bv. lysosoomale eiwitten zuurdere pH
→ pH bepaald Q => oplosbaarheid en activiteit eiwit
• Zout bv. NaCl
=> geen denaturatie + goed oplossen
• Proteasen inhibitor => geen afbraak eiwit
=> ≠ proteasen => bindt AZ/metaal in de katalytische site => inhibitie katalyse
=> tablet: mengsel meerdere protease inhibitoren
!met/zonder EDTA (als activiteit doel-eiwit beinvloed door EDTA bv. DNAsen)
o PMSF, BZA, aprotinine => serine proteasen bv.trypsine, thrombine, kaklikreine
o EDTA => Metalloproteasen
o Leupeptine => Cysteine proteasen (/thiol)
o Pepstatine => Aspartaat proteasen bv.pepsine, renine, cathepsine
• Event. Fosfatase inhibitor => geen defosforylatie
=> vaak mengsel meerdere
o NaFloride, NaPyrofosfaat, B-glycerofosfaat => Ser-/threonine fosfatasen
o NaOthovanadaat => Tyrosine fosfatasen
• Event. Detergent bv. NP40, Trition-X100, CHAPS,SDS
=> oplossen celmembraan, bij eiwitten die niet oplossen in H2O-opl.
• Event. Reducerend stof bv. DTT, 2-mercapto-ethanol
=> bregen SS-bruggen
Verdere opzuivering eiwitten
Chromatografie of elektroforese
Aanmaken van eiwitten
Doel
- Eiwit functie/structuur bestuderen, antistoffen zoeken tegen eiwit
- Eiwitmedicijn: antillichaam (tegen bepaald eiwit)/hormoon/enzym
- In waspoeder (lipasen,..) en voeding (enzymen,…)
Chemische synthese in vitro
Werking: synthese van C → N-terminus
1) Koppeling harsparel+peptidelinker aan carboxyterminus AZ
→ beschermingsgroep op N-terminus en zijketens AZ => bindt niet
2) Verwijder bescherming N-terminus
3) Koppeling C-terminus nieuw AZ (met protectie) aan N-terminus vorige
4) Repetitie
5) N en zijketen deprotectie + afklieven eiwit van hars en linker
=> °eiwit
, Pos: de novo synthese artificiële eiwitten (AZ die niet in natuur voorkomen)
niet toxisch voor organisme + onafh. AZ-beschikbaarheid
Neg: duur, enkel kleine hoeveelheden
koppelingsefficiëntie per cyclus (1AZ) = 99% => enkel korte seq. (max. 50 AZ) 1%fout
→ oplossing: langer eiwit door koppelen 2 peptiden van 50AZ
↳neem N-protectie af van peptide1 en harsparel van peptide2 (vrije carboxy)
Toep: maken artificiële eiwitten, peptiden voor antistofproductie
Enzymatische synthese in vitro
In vitro translatie RNA in konijn reticulocyt lysaat (of terwekiem extract)
↳ gespecialiseerde TLN machinerie: ribosomen, AZ, E (+geen DNA)
Kan 1e in vitro TXN (DNA→RNA), daarna in vitro TLN (in 2 of 1 reacties)
Pos: snel, eenvoudig
Neg: kleine hoeveelheden
Toep: bepalen ORF (welke AUG van RNA is startcodon)
structurele en functionele studie (impact mutatie)
In vivo expressie systemen
!voor en nadelen organismes
Recombinante eiwitproductie:
1e recombinant DNA in plasmide kloneren => in organisme: TXN + TLN → recombinant eiwit
=> eiwit vrij door lyseren cellen/ secretie in medium
Gekozen organisme bepaalt expressie plasmide
Codon optimisatie:
Genetische code = gedegenereerd: synonieme codons => zelfde AZ
→ abundantie codon afh. organisme/celtype => keuze codon afh. #tRNAs voor codon aanwezig
Dus ∆DNA sequentie naar aanwezigheid tRNAs => ∆ snelheid TLN (<> gelijke eiwitsequentie)
→ Hogere eiwitexpressie als veel tRNAs voor dat codon aanwezig
Transiente eiwitproductie:
- Korte periode (dagen)
- dmv transfectie: geen integratie recombinant DNA in genoom organisme => DNA in cellen
verdunt
Stabiele eiwitproductie:
- Lange periode (maanden)
- dmv transductie: recombinantie DNA in genoom gastheer => blijft in dochtercellen aanwezig
Productie op laboratoriumschaal (1ml cryotube-1L fles) vs industriele schaal (opschalen tot max
1000L
↳ 1-10x106 cellen ↳ 300x109 cellen tank)
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur paulinebal. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €4,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
80364 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans