METHODEN IN HET BIOMEDISCH
ONDERZOEK 3
, 1. Introductie
Enkele termen
Multi-omics: combineren van Omics
Bulk omics: Transcriptomics, proteomics, … alles direct bekijken
Single cell omics: single cell transcriptomics, single cell proteomics, … Elke cel apart analyseren
Spatial omics: spatial transcriptomics, spatial proteomics, … Plaats van transcripten, proteïnen in het
geheel bepalen.
Fluxomics: Bekijken naar veranderingen in signaalpathways, bv: glycolyse
Genmodulatie: Iets in vitro toevoegen aan een systeem nv. Crisp Cas9
Data-intelligence: Visualisatie van de data van je sequencing
2. Methoden voor DNA
1. First generation sequencing
-Sanger
-Maxam en Gilbert
-kleine projecten
2. Second generation sequencing
~Next-generation sequencing
-454 Roche
-Illumina
-ABI-Solid
-IonTorrent
3. Third generation sequencing
(-Helicos)
-Pacific Biosciences
-Nanopore
4. Epigenetica
-Bisulfiet sequencen
-Reduced representation Bisulfiet sequencen
-Immunoprecepitatie sequencen
5. Single cell sequencing
-PCR
-MDA (multiple displacement amplification)
-MALBAC (Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles)
6. DNA-genotyperen
- Short-tandem repeat genotypering
-Taqman genotypering
-Microarrays -> Illumina, Affymetrix, methylatie, CNV
7. DNA-hybridiseren
-FISH, CGH
,Inleiding
Sequencen van 1 genoom -> 2000 – 10 jaar, 3 biljoen, 100den wetenschappers
->2015 – Enkele uren, 1000 euro, 1 wetenschapper
→ Toepassen van sequencen:
▪ De novo genoom sequentie bepaling
-- Adhv. Puzzelen met overlap
▪ Resequencing
--Tov. Referentie genoom mappen
--Mutaties vinden
--Pharmacogenetica (personalized medcine)
▪ Sequentiebepaling als teller
--Hoeveel keer iemand een bepaald DNA of RNA heeft
1ste generatie sequentie bepalingen
• Maxam en Gilbert
~Chemische klievingsmethode
+ -
Geen Niet specifiek
Korte fragmenten
• Sanger sequencing
▪ Dideoxy-ketens
▪ Polymerase + primers + 4 dNTPs + ddNTPs (met fluorescent label)
▪ Elektroferogram (van capillaire elektroforese)
▪ 1-30 basen niet afleesbaar
▪ Phred score per base (>30) = kwaliteit score
▪ Mutatiedetectie →2 verschillende basen want 2 verschillende allelen
, Voorbeelden 1st generation sequencing (Sanger)
1. Human genome project (YAC, BAC, hierarchical shotgunning, referentiegenoom)
2. Celera = eerste individuele genoom
3. Automatisering van sequencing
4. Meer delen van data experimenten
5. Evolutie bestuderen
6. Personalized medcine -> farmacogenomics
7. Ethische commissies
2de generatie sequentie bepalingen
~Short-read next-generation sequencing in grote hoeveelheden
→ streven naar 1000-dollar genome
+ -
Snelheid Korte read lengte (korter dan Sanger)
Kost Veel fouten
Weinig input nodig Niet 100 maar 99,99% accuraat
1. Inleiding, hoe werkt het sequencen
STAP1: Maken library: WGS, Mate pair library, WES
1. Kwaliteit controleren van DNA
-Hoeveelheid en concentratie (spectrometry)
-Zuiverheid (spectrometry A260/280)
-integriteit -> is het nog in 1 deel
→ elektroforese en uitsnijden
→ selecteren met magnetic beads
2. Fragmentatie
-sonicicatie, DNase
- OF ‘Tagmentatie’ (fragmenteren en adaptors
aanhangen in 1 stap adhv. Transposases)
3. End- repair
-Blunt maken door T4 polymerase
-5’ fosforyleren
-3’ A aanhangen adhv Taq polymerase
4. Adaptors bevestigen
-barcode
-PCR primers bevestiging
-ligatie met andere fragmenten
,STAP 2: in vitro amplificatie: miljoenen fragmenten maken
1. Emulsie PCR
2. Solid phase bridge amplification
3. Solid phase template walking
4. Rolling circle amplification
,STAP 3: Sequencen van clusters
1. Sequencing by synthesis met reversible chain terminators ILLUMINA
2. Sequencing by synthesis met single nucleotide toevoeging
-Pyrosequencing 454 ROCHE
-Ion-semiconductor sequencing IONTORRENT
-Sequencing by ligation SOLID
STAP 4: data analyse
2. De verschillende 2nd generation platformen
• Roche 454
+ -
Lange reads mogelijk Fouten bij repetities
Niet meer competitief
,Voorbeelden 454 Roche
➔ Watson’s genoom werd gesequenced
➔ Genoom van neanderthaler werd gesequenced
1. DNA library
1.Fragmenteren
2. size selectie op gel
3. gel extractie
4. adaptors toevoegen met
T4 DNA-polymerase
➔ B adapter is ge-
Biothynyleerd.
2. Emulsie PCR
3. Pyrosequencing
4. Data-analyse base calling
→adhv. Intensiteiten van signaal base toekennen →chromatogram waarde
+ fragment allignment and assembly
, • Illumina
+ -
Lage kost Korte reads
Hoge troughput
Hoge accuraatheid
Voorbeelden Illumina
➔ Van elk mensen ras wordt het genoom bepaald
➔ De route van emigratie uit Afrika bestuderen
➔ Kanker genotyperen
➔ Gepersonaliseerde geneeskunde
➔ Mammoeten genoom sequencing
1. Aanmaak DNA library
Adapters met volgende functies:
-binden en vorming van clusters op flow cel
-primer bindt sites
-sample identifiers ‘index sequentie’
2. Cluster amplificatie
3. Sequencing by synthesis met reversible chain terminators
-aangepaste polymerases nodig
-ddNTP plus fluorescent label
-sequentie aflezen in beide richitngen
4. Data-analyse
-base-calling
• ABI-SOLiD
+ -
Geen repetitie problemen Korte reads
Hoge accuraatheid Traag proces
,Voorbeelden ABI-SOLiD
➔ /
1. Library
2. Amplificatie
3. Sequencing by ligation
-interpreteren
van 4 kleuren
4. Data-analyse
Known
Distance
Rea Rea
d1 d2
Repetitive Unique
DNA DNA
Paired read maps
uniquely
Single read
maps to
, • Ion TORRENT
+ -
1uur Repitief moeilijk
Gewone nucleotiden Korte reads
Goedkoop
Real time
Voorbeelden Ion -Torrent
➔ Cancer
➔ Inhereted diseases
1. Library
De basic procedure (zie 4 stappen)
2. Amplificatie
Emulsie PCR
3. Ionsemiconductor sequencing
-Inbouw dNTP
-Er komt H+ vrij
-Stroomverandering
meten
-Meten van pieken
(repitief is dubbele piek)
4. Data calling
Rekening houden met pieken en dubbele pieken
3de generatie sequentie bepalingen
~Long-read sequencing
1. Inleiding
+ -
Lange molecules Hoge error rate
Repetitieve moleculen
Single-molecule sequencing
Real-time
2. Platformen voor 3th generation sequencing
• Helicos tSMS
/
• Pacific BioSciences
+ -
Lange seq /
Geen bias
Hoge accuraatheid >99,99%
