H1: Biochemische analyse: analytische performantie, kwaliteitscontrole en
kalibratie
1. Analytische performantie
1.1 Aard van de analyse
• Kwalitatieve analyse: identificatie, detectie of het aantonen van bestanddelen in een preparaat,
monster of staal
• Kwantitatieve analyse: informatie verzamelen over de hoeveelheid (gehalte, concentratie) van 1,
meerdere (partiële analyse) of alle bestanddelen (totaalanalyse) aanwezig in de te analyseren
materie.
o individuele analyse: van 1 specifieke component, vb glucose in serum
o Groepsanalyse: van een aantal verwante componenten, vb totaal eiwitgehalte in serum
→ Berust op de meting van een fysische of fysico-chemische grootheid die rechtstreeks of
onrechtstreeks evenredig is met de hoeveelheid te doseren bestanddeel:
o Volume, gewicht
o Stroomsterkte
o Massa
o Radioactiviteit
o Lichtabsorptie/-emissie/-fluorescentie
o ....
1.2 Specificiteit en Selectiviteit
• Specificiteit: Een reactie is specifiek, als ze enkel en alleen maar doorgaat met de stof dat men wenst
te doseren
o Specificiteit van een test: kan eventueel verbeterd worden door aanpassen van aantal
parameters: pH, complexvorming, temperatuur, voorafgaande eliminatie van interfererende
factoren ....
o Finaal dient de ideale test 100% specifiek te zijn → het geregistreerde signaal is enkel en
oeligheid (sensitiviteit) alleen afkomstig van het analyt
• Selectiviteit: Een test is selectief als hij een bepaalde voorkeur heeft voor de te doseren stof + ook
positief kan reageren met een aantal andere componenten
gevoeligheid van een methode wordt bepaald door de helling van de ijkcurve; i.e.
etsignaal vs. de concentratie
1.3 Gevoeligheid (sensitiviteit)
voeligheid = gemeten signaal/concentratie
= signaal per eenheidsconcentratie
• De gevoeligheid van een methode: bepaald door helling van de
Methode A
ijkcurve (van grafiek meetsignaal vs. concentratie)
• Gevoeligheid = gemeten signaal/concentratie
S2 Hoge sensitiviteit = signaal per eenheidsconcentratie
Signaal
Methode B Voor bepaalde technieken: ook term karakteristieke concentratie
Lage sensitiviteit
gebruikt als maat voor gevoeligheid (vb: atomaire
absorptiespectrometrie – zie later)
S1
Concentratie
Karakteristieke concentratie = de hoeveelheid (µg) van de te bepalen stof die een absorbantie van 0.0044 (=
1% absorptie) teweeg brengt → Wordt uitgedrukt als µg/ml/1% Abs of µg/g/1% Abs
Gepubliceerde gevoeligheidswaarden zijn goede referentie voor het afstellen + kalibreren van apparatuur
en/of het controleren of de analyse betrouwbaar is
1.4 Detectielimiet en Kwantificatielimiet
Detectielimiet (limit of detection – LOD)
• = minimale concentratie van de te bepalen stof die in staat is een signaal te veroorzaken dat 2x is van
het achtergrondsignaal (peak to peak noise) →is de concentratie die een signaal/ruis verhouding (S/N
= signal-to-noise ratio) van 2 teweegbrengt
1
, • Soms wordt ook de formule 3 x SD* blank signaal gebruikt
• Is analytisch belangrijker dan gevoeligheid, want signaalgrootte + achtergrondsignaal in rekening
wordt gebracht
• Detectielimiet ≠ gevoeligheidSensitiviteit
!!! en Detectielimiet
Detectielimiet =
Sensitiviteit A = Sensitiviteit B
De concentratie van een element
die een stijging in signaal geeft die Detectielimiet B < (=beter) Detectielimiet A
gelijk is aan de piek-tot-piek ruis
van de basislijn
Bepalings-methode A Bepalings-methode B
Signal/Noise (S/N) ratio = 2
Signaal
Signaal
Signaal
Piek-tot-piek ruis
van de basislijn
(‘background’)
Kwantificatielimiet (limit of quantification – LOQ)
8
= de laagste concentratie van de bepalen
9
stof die kwantitatief kan worden bepaald → wordt vaak gedefinieerd
als 10 x SD blank signaal
1.5 Blancobepaling
= fractie van totaalsignaal dat niet te wijten is aan de te doseren stof in het te analyseren staal
→ blanco voor achtergrondsignaal/ruis te meten
1.6 Accuraatheid
• = maat voor de afwijking van het experimenteel gevonden resultaat tov de (onbekende) werkelijke
waarde
• Vaak bepalde eisen aan de accuraatheid waarmee het analyseresultaat dient gekend te zijn bv:
maximale afwijking: 5%
• Indirecte benadering accuraatheid: recovery van een gekende hoeveelheid toegevoegde stof te
bepalen
1.7 Precisie
= maat voor de reproduceerbaarheid van de analyseresultaten
Als maat voor precisie gebruikt men de:
• Intra-variatiecoefficiënt= de gemiddelde afwijking tov het gemiddelde tijdens één en dezelfde
analytische run (onder dezelfde condities
→ bv. een staal 10x achter elkaar meten
→ within-run precision of repeatability
• Inter-variatiecoefficiënt= de gemiddelde afwijking tov het gemiddelde bij verschillende runs (onder
veranderde condities), vb van dag tot dag, verschillende operatoren, verschillende loten van reagentia
→ between-run precision of reproducibility
Bv. staal op dag 1 10X meten en een week later nog eens 10x meten
→ Kans dat hetzelfde resultaat is al kleiner dan intra
• De variatiecoeficient (VC): standaarddeviatie (SD) van verschillende metingen van hetzelfde staal
gedeeld door gemiddelde waarde (µ) van de verschillende metingen van het staal (VC = SD/µ)
o VC reflecteert de imprecisie
o VC: variatie uitdrukken tov concentratie
o Hoe hoger VC, hoe slechter meting
Een goede precisie impliceert niet automatisch een goede accuraatheid !!! Altijd precisie en accuraatheid
bepalen bij verschillende concentraties tijdens analytische methode
2
, 1.8 Concentratie van een bestanddeel, SD en VC*
Concentratie van een bestanddeel, SD en VC* 1: VC coëfficiënt die hoog is bij lage concentratie + SD
is constant voor concentraties → geen goede
methode want VC veel te hoog
VC
2: VC stabiel over grote concentratie range
Signaal
SD SD
→ dit heb je als variatie op meting beetje omhoog
gaat met stijgende concentratie
SD
VC
VC 3: VC ongeveer gelijk bij toenemende concentratie,
maar wel hoog bij lage concentratie → geen goede
Concentratie Concentratie Concentratie
methode
SD constant VC constant gemengd
Precisie hangt veelal af van de concentratie van het te bepalen element
→ dient bij variërende concentraties te worden bepaald !!!
* SD= standaarddeviatie
LOD,VC=
LOQ, LOL, dynamisch bereik
variatiecoefficiënt
14
1.9 LOD, LOQ, LOL, dynamisch bereik
LOL Hoe stijler curve, hoe gevoeliger test
Dynamisch bereik: stuk curve waarin je kan kwantificieren (want
Signaal
best meten in lineiar dele curve)
LOQ Helling bepaalt sensitiviteit
LOD
Dynamisch bereik
Ruis
Concentratie
LOD: Limit of detection
LOQ: Limit of quantification
LOL: Limit of linearity
15
2. Kwaliteitscontrole van de biochemische analyse
2. Kwaliteitscontrole van de biochemische analyse
Interne kwaliteitscontrole laboratoriumanalyses
Control charts 2.1 Interne kwaliteitscontrole laboratoriumanalyses : control charts
stable
performance
accuracy problem:
shift in mean
precision problem:
increase in SD
Op verschillende tijdstippen meten en gemiddelde nemen → zo zien of wat
je meet wel juist is
2: gemiddelde meting ligt lager dan degene die we zouden moeten meten,
variatie wel nog goed (alleen accuraatheid is niet goed)
3: gemiddelde oke, variatie toegenomen (kan bv. maand later zijn)
3
, 2.2 Externe kwaliteitscontrole
Analytische performantie op basis van:
o Recovery geaddeerde compound = maat voor accuraatheid
o Afwijking tov het consensus gemiddelde (= gemiddelde alle deelnemende laboratoria) = maat
voor accuraatheid
o Verschil tussen in duplo analyses = maat voor precisie
3. Kalibratie van de biochemische analyse
• De kalibratiefunctie: y = f(x) → gegenereerde signaal y, x is de concentratie van het te bepalen
bestanddeel
• de meetfunctie: x = f’(y) (omgekeerde functie) → concentratie bestanddeel (x) bepaald worden obv
bekomen signaal (y)
• functies bekomen door meting van een aantal kalibrators (stalen met gekende hoeveelheid van het de
bepalen stof)
Externe kalibratie: kan worden toegepast wanneer het bekomen signaal niet onderhevig is aan
matrixeffecten (bv. analyse van glucose in biologisch materiaal (vb serum) tov waterige
standaarden/calibrators)
→ glucose oplossen in water en als standaard gebruiken
→ glucose memten in serum en geeft zelfde signaal als glucose in water, dan water als kalibratie gebruiken
Interne kalibratie: is vereist wanneer
o het gegenereerde signaal onderhevig is aan matrix of chemische interferentie
(vb reactie tussen matrixcomponenten en het te bepalen bestanddeel ...)
o de methode en/of meetapparatuur het voorwerp is van fluctuerende experimentele parameters
(bv schommelingen in de temperatuur vlam of in de opzuigsnelheid van het monster bij
vlamfotometrie) tijdens de analyse
o voorbeeld: gekende hoeveelheid glucose toedienen en meten met en zonder glucose
3.1 Externe kalibratie
Kalibratie (standaard staal) in andere vloeistof dan staal zelf
• Ook wel directe kalibratie genoemd
• Soorten: éénpunts- en meerpuntskalibratie (ijklijn of kalibratiecurve)
Eénpuntskalibratie
• Hierbij wordt Sx (signaal onbekend staal) vergeleken met dit bekomen door slechts 1 calibrator:
Ss = kCs (calibrator)
Sx = kCx (onbekende)
→ Wanneer Cs, Ss en Sx gekend kan de concentratie berekend: Cx = Cs.Sx/Ss
• Nadeel:
o Lineariteit dient vooraf geverifieerd
→ Als standaard buiten lineaire curve valt, dan kan je niet meer vergelijken → je moet zeker
weten dan cocnentratie van standaards samen met staal in lineair deel ligt van curve
o Accuraatheid hangt af van slechts 1 ijkpunt
• Voordeel: geen ijklijn opstellen, dus maar 1 standaard maken en 1x meten
Meerpuntskalibratie (ijklijn)
Verdunningsreeks van een standaardoplossing van de te doseren component met telkens gekende
concentratie
A) Directe meerpuntskalibratie
Adhv signalen van standaard kan je concentratie onbekende stalen berekenen (adhv ijklijn)
→ Als stalen verdund hebben, dan nog wel concentratie ermee vermenigvuldigen
4
, B) Directe meerpuntskalibratie: ijklijn
• Bij voorkeur meten binnen het lineair meetbereik
• Vaak afwijking lineair verloop bij hogere concentraties
• Extrapoleer nooit naar meetwaarden die niet zijn opgenomen in de ijklijn!
→ grotere verdunning, kleinere monstername
• Sommige analyses (vb methode Lowry voor eiwitbepaling): er bestaat geen lineaire relatie
→ gebruik maken van niet lineaire regressie / log-transformatie voor verkrijgen van lineaire vorm
3.2 Interne kalibratie
Standaard staal toevoegen aan ander staal
A) Standaardadditiemethode
Gebruikt als hoogte van signaal verschilt tgv een verschil in de samenstelling van de matrix tussen een
(waterige) standaardoplossing en de matrix van het te analyseren staal maar ook tussen de stalen
onderling (bv verschillende serumstalen)
• Voor elk staal standaard moeten maken
• Standaard meten in staal en als je het doet voor verschillende stalen, dan meet je verschil voor die
stalen → verschil tussen stalen onderling
(Bij externe kalibratie maar 1 standaardreeks moeten maken)
Enkelvoudige (enkelpunts) standaardadditiemethode
• Ieder te analyseren staal met en zonder toevoeging standaardoplossing
• Bv bepaling van aluminium in serum
200 µl serum + 300µl H20
200 µl serum + 300µl standaardoplossing 20 µg/l aluminium in H 20
In dit geval is de additie dus: 300 x 20/200 = 30 µg/L
• Signaalverschil komt door toegevoegde standaard
• Beide metingen dienen te gebeuren onder dezelfde omstandigheden !
→ Bij voorkeur zelfde verdunning voor onbekende en geaddeerd staal
• Nadeel: Accuraatheid afhankelijk van slechts 1 punt + lineariteit dient vooraf geverifieerd
• Naast het opstellen van een ijklijn (zie verder) kan bij enkelvoudige standaardadditie, bij gebruik van
dezelfde finale volumes, de concentratie ook worden berekend op basis van:
Cx = Cs.Vs.Sx/Vx.(Sx+s – Sx) (x is van onbekende, s is van standaard en S van signaal
Meervoudige (meerpunts) standaardadditiemethode
• Voor elk staal verschillende standaardoplossingen gemaakt
• Voordeel: betere controle van de lineaire range
• Nadelen
o tijdrovend (↔ bij moderne toestellen gebeurt toevoegen standaarden automatisch)
→ voor elk staal moetje standaardreeks doen
o voor sommige analyses kunnen relatief grote hoeveelheden van het te analyseren staal
nodig zijn (groot volume nodig)
Stock-
standaard Verdunningsreeks in standaardoplossing toevoegen aan hoeveelheid staal
blanco-oplossing
X+K1 enzo meten
X+B geeft ook signaal, want deel staal zit er ook in
Blanco- Kalibrator 1 Kalibrator 2 Kalibrator 3 Kalibrator 4
Bekomen grafiek niet door 0 want in blanco staal zit te
oplossing CK1 CK2 CK3 CK4
0 µg/L vb 10 µg/L 20 µg/L 50 g/L 100 µg/L
meten hoeveelheid stof
Ijklijn doortrekken naar 0 en dan kan je concentratie
VB VK1 VK2 VS3 VK4
oplossing x afleiden
Onbekend staal Vx
erne kalibratie
x+B
Standaardadditiemethode
x + K1 x + K2 x + K3 x + K4
Sx1+A
Signaal A=
geaddeerde 5
standaard
, Verschil tussen standaard in waterig milieu tov staalmilieu
dus geen externe kalibratie kunnen doen (op voorhand dit
al testen)
Signaal A is te wijten aan geaddeerde standaard
→ ookal zelfde hoeveelheid standaard toevoegen,
krijg je niet zelfde hoeveelheid toename in signaal
→ standaard additie op elk staal apart moeten doen want
die toename van piek is bij 1 en 2 dus anders
B) Additiecalibratiemethode
Wordt toegepast wanneer de samenstelling van
Sx1+A verschillende de te analyseren monsters (biologische
Signaal A= matrix) geen effect heeft op het gegenereerde signaal
geaddeerde
standaard van de stalen onderling
30 µg/L
Sx1 (vb bepaling van een bepaald bestanddeel in een reeks
serumstalen) maar er wel duidelijk matrixeffecten waar
te nemen zijn in vergelijking tot bv een waterige
Staal x1 Staal x1 + A Cx1 0 30 µg/L Additiekalibratie standaard.
Signaal
mogelijk
Geen verschil tussen serumstalen onderling
Sx2+A
→ zelfde verhoging signaal dus zien. Er is wel verschil
Signaal A=
geaddeerde tussen watering milieu en biologische matrix staal
standaard
30 µg/L waardoor geen externe doen
Sx2
Staal x2 Staal x2 + A Cx2 0 30 µg/L
Meetprofiel Concentratie
Interne Kalibratie:
KalibratieplotKalibratieplot: hier met inerne kalibratie ijklijn maken
- Rode bol: signaal staal waar je blanco aan hebt
toegevoegd
C
- Blauwe bollen: signaal stalen van staal +
B
3. extrapoleer verschillende concnetraties standaard
2. spike
Signaal
naar 0 A samp
conc. x+ le: meet bij - Hier is meerpuntscalibratie
A, x+B, x
+C - Doortrekken naar 0 (niet door oorsprong want in
1. meet blanco ook nog staal)
signaal b
ij conc. x
- Wel absolute waarde nemen van concentratie die
je vindt
x
Concentratie
4. lees conc. x af
32 van kalibratieplot
6
, Interne Kalibratie:
Standaardadditie ↔ externe standaardisatie
standaard- Matrix B *Blauw: standaard oplossen (in verschillende
additie concentraties) in waterige oplossing
y: a'x + SB
Matrix A
*Rood: standaard oplossing toevoegen aan staal
(matrix A genoemd) → curve schuif op naar
externe
standaardisatie Waterige boven, omdat er hoeveelheid component in zit
Signaal
y: ax + SA standaard dat je wilt meten
→ Rico rechte gelijk → hier kan je externa
SB standaardisatie doen want in matrix en water
zelfde rico
SA
y: ax *Groen: signaal in matrix met standaard is
anders tov signaal in water met standaard
(standaard additie kunnen doen bv.)
Concentratie
C) Methode van de inwendige standaard
33
• inwendige standaard (IS) verschilt van standaardadditiemethode
o IS: toegevoegde standaard is niet chemisch gelijk aaan te doseren component
o standaard-additiemethode: geaddeerde standaard is chemisch identiek is aan de te doseren
component.
• De IS van bij start analyse toegevoegd → ondergaat zelfde manipulaties als het te doseren
bestanddeel → automatische correctie voor mogelijke verliezen/aanrijking tijdens de
voorbereidende stappen van de analyse
(vb, tijdens maken van verdunningen, verwijderen van interfererende stoffen,..)
→ Verhouding Cx/CIS blijft onveranderd tijdens het ganse analyseproces
→ Finaal gemeten signaal SIS wordt voor elk staal gerelateerd aan de oorspronkelijk toegevoegde
hoeveelheid IS
• Methode van de IS corrigeert automatisch voor matrixinterferentie en schommelingen van
experimentele parameters
• Deze methode kan je niet altijd gebruiken → vooral als staal ingewikkelde behandeling moet
ondergaan → want inwendige standaard moet je direct toevoegen na staal afname + doet heel
process mee
Vereisten waaraan inwendige standaard moet voldoen
• De IS mag niet voorkomen in het te analyseren staal, bv:
o lithium als IS voor de vlamfotometrische bepaling (zie verder) van natrium in serum
gezien dit element in normale omstandigheden niet voorkomt in serum (opletten:
manisch depressieve patiënten worden behandeld met lithiumcarbonaat)
o soms wordt ook meer dan 1 IS toegevoegd voor multi-element analyse
• Het signaal van de IS (SIS) en het te bepalen element (SX) dient simultaan te kunnen worden
gemeten
• IS moet chemisch verwant zijn met het te bepalen element
vb: lithium en natrium zijn beide alkalimetalen
• Signalen van het te doseren bestanddeel en IS mogen niet samenvallen:
o verschil in emissiegolflengte bij vlamfotometrie
o verschil in retentietijd bij gaschromatografie
o verschil in massa bij spectrometrische analyse
Berekening van de concentratie
• Gelijkenis met éénpuntskalibratie:
o verhouding signalen ~ verhouding concentratie
o bij IS kalibratie: standaard + te bepalen bestanddeel verschillen chemisch van elkaar
→ verschil in gevoeligheid voor toegepaste analysemethode
7
, → toepassing correctiefactor = antwoord- of responsfactor (RF)
• Responsfactor dient vooraf experimenteel te worden bepaald
→ vb door vergelijking van de richtingscoëfficient van ijklijnen op basis van
verdunningsreeksen van standaardoplossingen van IS en te bepalen bestanddeel:
→ RF = signaal X/signaal IS (of vice versa) bij gelijke concentraties
(RF= hoogte signaal dat gegenereerd wordt voor de te bepalen component)
Meting van aluminium met indium als inwendige standaard
Staal x2
In
Bij 2 is signaal Al kleiner maar van indium gelijk →
Indium-piek gelijk goed want stalen dan vrij gelijkaardig behandeld
• Geen verandering in condities
(temperatuur, debiet, hebben
Al viscositeit, …) meting x1 vs x2
Staal x1 • Signaal x1/I.S. > Signaal x2/I.S. Bij staal 1 is conc. Al groter dan in tweede staal,
Inwendige • Cx1 > Cx2
Standaard
In want verhouding is groter
(I.S.)
vb. indium
Staal x2 I.S.
30 µg/L Al
Onder staal 2: piek indium kleiner: deel indium
Signaal
Staal x2
verloren gegaan tijdens staalvoorbereiding
Indium-piek verschilt
• Verandering in condities
→ Al dus ook verloren gegaan tijdens
In
meting x1 vs x2
• Signaal x1/I.S. < Signaal x2/I.S.
staalvoorbereiding → initiële conc. Al is groter
Al
x1 I.S. • Cx1 < Cx2
Stalen bevatten
geen indium
37 x2 I.S.
4. Verschillende fasen en fouten van de biochemische analyse
4.1 De verschillende fasen van een chemische analyse:
A) Definiëren van het analyseprobleem
Welke info wordt gevraagd? Zijn voor de gevraagde analyse reeds procedures beschikbaar? Welke
apparatuur staat ter beschikking? Kunnen er eventuele interferenties optreden?...
B) Monstername
• Is de monstername representatief voor het geheel?
o Keuze biologische matrix?
o Heterogene ↔ homogene matrices
• Monstervolume? (hoeveel heb ik nodig? Zodat niet te veel afnemen)
• Wordt de nodige aandacht gegeven aan het nemen van voorzorgen ter voorkoming van
contaminatie, chemische ontbinding (bv oiv licht, temperatuur)?
• In vele gevallen is het aanbevolen een extra hoeveelheid te bemonsteren voor eventuele
controle of tegenexpertise
• Monstername is even belangrijk als de eigenlijke analyse !!!
C) Voorbereiden monster
• Reinigen van het monsteroppervlak
• Verwijderen van water door drogen in droogstoof of oven
o Vaste stoffen kunnen variërende hoeveelheden water bevatten
o Uitdrukken van concentratie droog ↔ nat gewicht vaste stof
• Digestie dmv bv salpeterzuur = vaste stof in vloeistof wordt omgezet
• Isoleren van serum of plasma uit volbloed
→ Plasma: bloed gestalt
→ Serum: bloed nog niet gestolt dus bevat nog wel stollingsfactoren
8
, D) Procedures voor eliminatie van interferenties of aanrijking van de concentratie
Voorbeelden voorbehandelingsmethoden: filtratie, dialyse, centrifugatie, chromatografische technieken,
precipitatie,..
4.2 Fouten in kwantitatieve analyse
• Kwantitatieve analyse: is meer dan enkel de meting
• Elke stap in het analyseschema dient door de analyst als mogelijke bron van fouten te worden
onderkend (bv. monstername, bereiding oplossingen, maken verdunningen, instellen
apparatuur,…)
• Het bekomen van de exacte waarde is theoretisch onmogelijk
→ chemische analyse: eerder als doel een resultaat bekomen dat binnen bepaalde grenzen (bv
>99%) kan worden vertrouwd
→ de analytische performantie dient zo hoog mogelijk te zijn
2 groepen fouten bij chemische analyse
Systematische fouten
• Instrumentele fouten
o Zijn te wijten aan de gebruikte apparatuur
o Kunnen tot een minimum herleid worden door voorafgaande controle en ijking van de
apparatuur
• Methodische fouten
o Zijn een gevolg van de gekozen methode
o Kunnen worden opgespoord door de gebruikte methode te toetsen aan twee of meer
onafhankelijke methodes
o Kunnen worden verholpen door verdere studie en optimalisatie van de methode
• Persoonlijke fouten
o Worden bepaald door de handigheid (‘skills’) van de analist
o Kunnen worden geminimaliseerd door intensieve training en ervaring
o Soms is vergelijking van de analyseresultaten van verschillende analisten noodzakelijk om
persoonlijke systematische fouten op te sporen
Systematische fouten geven aanleiding tot fouten met zelfde waarde (constante fouten)
Na het minimaliseren van de systematische fouten zullen tijdens het analyseproces nog steeds
variaties van onbekende oorzaak (toevallige) fouten optreden die eventueel tot op zekere hoogte
behandeld kunnen worden met statistische methoden
Verwerpen van resultaten
• Als resultaat afwijking vertoont t.o.v. de gemiddelde: nadenken of je het mag verwerpen
• Methodes om outliers te identificeren
o Gebasseerd op de gemiddelde afwijking: d̅
Als meetresultaat > 4x d̅: resultaten verwerpen
o Gebasseerd op standaard afwijking: s
Als meetresultaat > 3x s: resultaat verwerpen
H2 radio isotopen heb ik ook, maar samenvatting is maar half opgeslagen. Ik had het document wel al
afgedrukt, dus ik kan het inscannen en doorsturen.
9
, H3: Spectrometrische analysemethoden (H3.1)
Moleculair: UV/VIS
1. Inleiding
• Licht interfereren met atomaire en/of moleculaire stelsels
• Spectrometrische analysemethoden berusten op deze interactie tussen materie en
elektromagnetische straling
• EM straling= een energievorm die zich in de ruimte met zeer grote snelheid voortplant en in
verschillende vormen kan voorkomen (zichtbaar licht, warmtestraling)
• EM straling: transversaal (=loodrecht op een andere richting) golfverschijnsel met oscillerende
electrische en magnetische velden
→ golfverschijnsel omschrijven in termen van snelheid, golflengte, golfgetal en amplitude
straling beschouwen als een verzameling energiepakketten
(kwanta)
→ fotonen waarvan de energie in verhouding is met de
stralingsfrequentie
→ kwanta kunnen energie overbrengen naar atoom/molecule
1.1 EM spectrum
EM spectrum:groot bereik aan golflengte met bepaalde energieën → dus ook verschillende stralingsvormen
Soorten straling: hoe korter golflengte, hoe meer energie
• Radiogolven: langste golflengte, kleinste frequentie, laagste energie
• Microgolven: gebruikt in microgolf
• Infrarood straling
• Zichtbaar licht: maar zeer beperkt deel van EMS → golflengte‐gebied 380 nm tot 780 nm
o Blauw licht: hogere energie inhoud (kortere golflengte)
o Rood licht: lagere energieinhoud (langere golflengte)
• Ultraviolet straling: energie inhoud is al zo groot om C-C, C-N en C-H bindingen te breken
→ dit type bindingen staan centraal in opbouw cellen enzo
• X-stralen (zacht en hard): röntgen foto’s
• Gamma stralen: meest schadelijk, hoogste energie, kortste golflengte
→ Infrarood tot X stralen meest gebruikt in analytische toepassingen
→ Onzonlaag filtert al meesch schadelijke straling
*Het elektromagnetisch spectrum: Golflengtebereik van de verschillende kleuren
Stof analyseren: willen weten welke kleur geabosbeerd wordt. Als je gele gekleurde stof hebt, dan is al de rest
geabsorbeerd. Molecule in oplossing kan niet met die energie inhoud reageren. Gele kleur wordt weerkaatst, al
de rest geabsorbeerd en daarom dat wij geel zien
*Het EM spectrum: toepassing
Golflengte‐/Energie‐/frequentiegebieden van het elektromagnetisch spectrum die toepassing vinden in de
spectrofotometrie
Bv. Microgolven: eten word warm
→ rotatie watermoleculen wordt beïnvloed → meer trillingen betekent opwarming
1.2 Relevante golfparameters
*Frequentie
Frequentie = aantal trillingsdoorgangen t.h.v. een bepaald punt per seconde (Hertz; Hz = 1 cyclus/sec)
10
