HF2: DRUG DESIGN & DISCOVERY
1. Bespreek de sterkten en zwakten van de twee verschillende wijzen voor de ontdekking van geneesmiddelen.
Geef ook enkele voorbeelden.
1. Phenotypic durg discovery
= Emperisch, holistische methode (waarbij je richt op observeerbare technieken van een
organisme/cel en niet op een specifieke target).
- Voordelen:
o Niet nodig veel details te weten over mechanisme van de pathologie
o Verhoogde kans op een first in class medicament
o Kan in vivio gebeuren dus indirect wordt ADME ve GNM ook getest
o Aanpak = target unbiased meer compounds kunnen worden getest.
- Nadelen:
o Weinig kennis over de target optimalisatie van de compound wordt moeilijk
o Vaak lage throughput screening (je kan een paar samenstellingen testen, maar zeker geen 1000
van hen.
- Voorbeeld
o In vitro antiproliferatie assay (cel)
Tumorcellen worden geisoleerd en in een medium geplaatst gaan sterk delen &
proliferen daarna gaat men anti-tumoraal compound toevoegen (combineren met
compound die van kleur verandert wanneer deze metabolisch door de cellen wordt
geprocessed) cellen stoppen met delen en afhankelijk van metabolische activiteit, hoe
minder proliferatie plaatsvond zal de kleur minder ontwikkeld zijn.
o In vitro anitimuroale assay (dier)
Gebruik van dieren kosten stijgen enorm
Immuundeficiente muizen injecteren met een kankercellen cellen gaan prolifereren
muizen gaan kanker ontwikkelen tumor wordt groter ifv tijd.
2. Target-based drug discovery (TDD)
= rationale, moleculaire methode gebaseerd op de kennis van pathologiemechanisme
veel onderzoek werd verricht naar de target met veel biomedische kennis & data
- Voordelen:
o Hoge througput screening
o Monoclonale AB approuch is mogelijk
o Rationale methode = intellecutueel aantrekkelijk
- Nadelen
o Target validatie is belangrijk: betekent niet dat het gaat werken in menselijk lichaam/ ziektebeeld ge
moet die dus nog valideren & kijken of ge met deze compound & target effectief een impact kan hebben
op het ziektebeeld
o Relevant in grotere context?
- Voorbeeld:
o In vitro kinase essay (enzyme)
~ELISA procedure: peptide op 96-well plaatsen overnacht toevoegen kinase enzyme +
ATP peptide wordt gefosforyleerd (niet zichtbaar) toevoegen van AB gelinkt aan
HRP-enzyme dat het gefosforyleerd peptide herkend Toevoegen van TMB reagent
HRP zal in aanwezigheid van TBM kleur afgeven hoe meer gefosforyleerd peptide –
hoe meer kleur.
Toevoegen van kinaseinhibitor zal zorgen voor verlagen van de kleur
Toont dat je compound of interest dan wel een kinaseinhiberende functie heeft
o In vitro kinase essay (reporter cellijn)
o In silico drug design (PC
Kristalliseren van eiwitten in specifieke cotities analyseren mbv X-ray krijgen van
gedetailleerde structurele informatie van de conformatie van het eiwit.
je kan dit combineren met co-kristalisatie samen met een inhibitor
1
,2. Bespreek 2 target identificatie/ deconvolution strategieën in de ontdekking van geneesmiddelen.
1. Affiniteits chromatografie gebasseerde methode:
= wordt gebruikt om eiwitten die op specifieke target binden op basis van affiniteit (= via Vanderwaals krachten of
hydrofobe krachten).
- Ligand (L) en het target-eiwit (P) gaan LP-complexen vormen en er zal zich een evenwicht vormen (LP <> P +L
) met Kd als dissociatieconstante. Hoe groter affiniteit van L hoe meer complexen worden gevormd.
- Als je target-eiwit wil identificeren in mengsel: optimale situatie = eiwit voorkomt in hoge concentratie zal
makkelijk target vinden,
o MAAR target of interest zijn vaak eiwitten met lage abundantie (voorkomen in de ruimte) en eiwitten
gaan rapper binden aan targets met hogere abundantie
o EN als er veel targets zijn, gaat er ook lagere abundantie zijn van specifiek target ook moeilijker om
target van interest te binden
- Kan je combineren met linker om gebonden moleculen te scheiden.
- Werking:
o LAADFASE: Kolom met immobiele fase (=covalent gebonden) / staal aanbrengen (= cell homogenate
met daarin target vd small molec)
o SPLITSINGSFASE: Bij interactie tussen L & P binden anderen gaan er tussendoor vloeien
o ELUERING: veranderen van pH target elueren uitvoeren van SDS-PAGE & coommasie gevolg
door MS zo EW-fragmenten identificeren en EW identificeren.
2. Expressie-klonering gebaseerde methode:
= ook gebasseerd op affiniteit maar hier wordt een celsysteem gebruikt.
- Voordeel: geen lage abundantie van target-ew
- Nadeel: geen of verschillende postranslationale modificaties versch EW-vouwing (bij gebruik van yeastcels
bv.)
- Three-hybrid system:
o PART 1 – fusie-proteïne (expressed in all cells)
Bestaat uit 1. DNA bindend domein & 2. ligand bindend domein (DHFR)
Dit zal weg vinden naar DNA van de yeast
o PART 2 – linker systeem (small molec gelinked à MTX)
MTX zal zichzelf linken aan DHFR (=DNA-bindend domein)
MTX bevat linker met small molec die zal binden aan het targetmolec
Zo targetmolec dicht bij DNA brengen
o PART 3 – fusie proteine (expressed in individuele cellen)
Bestaat uit transcriptioneel activatie domein( expressie van LacZ) en een proteine van cDNA
(=potentiele target)
o Target gaat interageren met small molec zo dicht bij reportergen expressie v B-gal B-gal
reactie
2
,HF3: DRUG DELIVERY & DISPOSITIE
3. Geef een overzicht van de fysicochemische en biofarmaceutische aspecten die bestudeerd worden tijdens de
preformulatie fase als deel van de “farmaceutische profilering” van een API.
1. Oplosbaarheid
- = belangrijkste fysicochemische eigenschap
o Bepaalt:
Doseringsvorm (injecteerbaar, orale oplossing,..)
Toxicologische studies, farmakokinetische studies (hoge oplosbaarheid nodig om tot hoge [ ] te
gaan & toxicologie te meten)
Orale biobeschikbaarheid = bepaald dr oplosbaarheid in GI-vloeistoffen
• Lage oplosbaarheid orale toediening BBH ~ 0 wnt lostnietop in GI
- Biopharmaceutics classification system (BCS) = opgesteld adhv oplosbaarheid & permeabiliteit
- Wordt bepaald door temperatuur water, pH, buffers, ionischte sterkte, biorelevante media (FASSIF, FESSIF =
fast at state stimulate/ fed state stimuladed intestinal fluid)
- Producten die oplosbaarheid kunnen verhogen:
o Cosolventen (PG, PEG, glycerol,…)
o Complexe agents vormen complexen (bv. cyclodextrins)
o Surfactans, polymeren
- HPLC = hoge trhougphut set up oplosbaarheid meten
2. Dissolutiesnelheid
= snelheid waarbij een compound oplost snelheid waarbij een bepaalde [API] kan worden verkregen bij bep T &
hydrodynamica.
= belangrijk voor orale BB (indien niet opgelost tegen bep
deel in GI API niet opgenomen
- Nernst-Brunner vergelijking:
o = hoeveelheid massa dat kan oplossen in functie
van tijd
o API = donkere bol
o Diffusielaag, waterlaag = lichtblauwe rand
Hierin gaat concentratie van Cs (saturatie) verlagen naar Ct (bulk) over bepaalde afstand h
o D= diffusie coef, S = opp vh compound in contact met water
o beschrijft dus dissoluatieproces
- (indien dissoluatiesnelh = traaag niet alles zal opgenomen zijn
- Zal verandern naargelang medium (FASSIF & FESSIF w in vitro gebruikt als mimic v GI-vocht)
3. Ionisatiegedrag
= bepaling van pKa & pKb via Uv spectroscopie, in silico & petentiometrische titratie
Veranderen van pH van een oplossing om oplosbaarheid van API te verhogen/ verlagen
Als we inonisatiegedrag kennen van compound of interest nagaan of we zouten kunnen vormen ter
verbetering van de oplosbaarheid
= maken van zouten als strategie om compounds met lage oplosbaarheid beter te laten oplossen
4. Partitie coefficient/ distributie coefficient
= Log P, Log D = pH afhankelijk = ratio van concentratie van een compound ingv met concentratie in waterige fase.
o = indicatie van lipofiliciteit (oplosbaar in vetten) / (niet oplosb in H20) , in vivo absorptie (passieve diffusie over
GI).
o n-octanol = vaak als solvent gekozen komt meest overeen met lipofiliteit van MB gaat log P & D bepalen
3
, 5. Vaste stof eigenschappen
= is het API kristalijn of amporf (glass)? = in welke vorm lost het API op?
Kristallijn Amorf
3D vorm, kristalrooster Chaotische structuur ivgl vloeibar staat
Smelt punt Geen smelttransitie wel glass transitie = transitie van
Thermodynamisch stabiel toestand v lage moleculaire mobiliteit naar hoge staat v
= preferentiele vorm want meest stabiel mobiliteit)
o Thermodynamisch niet stabiel
Hogere chemische reactiviteit
Hogere oplosbaarheid & dissoluatie rate
o Molec ku geordend zijn id ruimte in versch manieren om rooster te vormen
= polymorfisme versch stabiliteit, smelpunt, oplosbaarheid, dissoluatierate,… MAAR eigenschappen in
vloeistof & gas = hetzelfde
I. Conformationele polymorfisme = versch conformaties v molec, ku roteren enzo
II. Configurationele/ stacking polymorfisme = zelfde conformaties v molec, maar stacken versch id
ruimte
o Solventen ku geincorporeerd zijn ih kristalrooster intermolec interacties tss API & solvent bepalen
bindingssterkte
= pseudopolymorfisme versch stabiliteit, smelpunt, oplosbaarheid maar in gas & vloeistof terug hetzelfde
o Belangirjk dit allemaal te weten wannt heeft een effect op BB en zo kunnen we beste stabiele vorm eruit halen
6. Chemische stabiliteit van API
- In vaste staat (wat is invloed van warmte, licht, water,…)
- In oplosbare vorm (idem, zuur, base, oxiderende omgeving,…)
- Compatibiliteit met hulpstoffen & packaging materialen: nagaan of die degraderende of wijzigignen veroorz à
API
7. Permeabilitiet / absorptie potentieel
= API moet geabsorbeerd worden in systeem om actief te
zijn ( testen in vitro, ex vivo, in suti methoden,..)
A. Parallel artificial membrane permeation assay
(PAMPA)
= acceptorvloeistof op donorvloeistof met lipidelaag
ertussen
indien hydrofiel lage MB passage
indien hydrofoob/ lipofiel hogere MB passage
Voordelen Nadelen
Geen dieren, Enkel partieel voorspelbara (passieve diffusie)
hoge doorvoer, veel exp tergelijkertijd Membraan retentie of lipofiele compounds
niet zo duur Performance is sterk afhankelijk van lipide compositie
versch MB-composities mogelijk pH
B. Caco-2 cel structuur = STANDAARD
= colonkankercellen in cultuur brengen gaan cellen Dud mimicken (versch brushborders & fase 2
enzymes tot expressie) op apicale kant dan API aanrbengen en dan kijken hoe snel concentratie API
aan basolaterale kant komt of omgekeerd
Voordelen Nadelen
Goed screening model Geen mucus (kan barrier vr absorptie zijn)
Geen bioanalyse Geen CYP3A4 = komt in echt wel voor
Geen dieren Strakke monolaag
Evaluatie transportsystemen Statistisch model
Evaluatie,absorptiestrategeien
Humane origine
Aanvulling cursus:
Na preformulatie fase komt formulatiefase want een pure API wordt niet à patient gegeven. Obv indicatie, dose,
fysicochemische, biofarmaceutische, route van adminisatratie,… wordt een geschikte dossage vorm ontwikkeld.
4
