Naam: Yilska Smet Klasgroep: 3 FBT B
Datum: 28/09/2020, 5/10/2020, 12/10/2020, 19/10/2020, 26/10/2020,
16/11/2020, 23/11/2020, 30/11/2020, 1/12/2020, 7/12/2020 en
8/12/2020
Docent: M. De Mesmaeker Academiejaar: 2020-2021
Labopartners: Jolien Dierickx en Kyana Couckhuyt
Vak: Labo Biotechnologie II Nr: 10
Kloneren van een gerecombineerd lambda DNA fragment in competente E. coli cellen voor de
bereiding van een DIG (Digoxigenine) gelabelde probe opgevolgd door een Southern blot
analyse met chromogene detectie
1 Doel [1]
Een λ-DNA-fragment met bepaalde grootte wordt in de gelineariseerde vector pGEM-3Zf(+)
geïntroduceerd. De vector en het was consequent λ-DNA-fragment worden verknipt door restrictie-
enzymen. Deze restrictie-enzymen zijn BamHI en HindIII. Vervolgens willen we de λ-DNA fragmenten
en pGEM-3Zf(+)-fragmenten opzuiveren na scheiding van een preparatieve agarosege lelektroforese.
De concentratie van de opgezuiverde fragmenten wordt bepaald via fluorometrische bepaling en via
agaroseg elelektroforese na kleuring met GelRed. Als DNA-merker wordt gebruik gemaakt van λ-DNA
verknipt door PstI voor de concentratiebepaling via agarosegel elektroforese. Beide methoden
worden achteraf vergeleken op basis van hun resultaten.
Hierna wordt met behulp van T4 DNA ligase de λ-DNA-fragmenten 493 bp en 784 bp geïntroduceerd
in het gelineariseerde plasmide pGEM-3Zf(+) 3167 bp met als resultaat twee recombinante
plasmiden, pGEM-3Zf(+)-HB493 3660 bp en pGEM-3Zf(+)-HB784 3951 bp. Het doel is om de
recombinante plasmiden in competente E. coli cellen te brengen en het te laten vermenigvuldigen,
kloneren, op een selectieve voedingsbodem namelijk een LB-agar medium dat ampicilline bevat. Dit
zodat er kolonies zouden groeien. Het Competent maken van de E. coli cellen is nodig om het
recombinant exogeen plasmide echter te laten op nemen en later te kloneren.
Vervolgens moeten de kolonies via kolonie PCR worden gecontroleerd of er effectief een opname
van de recombinante plasmiden pGEM-3Zf(+)-HB493 en pGEM-3Zf(+)-HB784 is. Vervolgens wordt het
resultaat na agarosegel elektroforese met visualisatie van GelRed geëvalueerd.
Ook aan de hand van restrictie-analyse met EcoRI en HindIII als restrictie-enzymen wordt het
resultaat van de klonering van de twee vermoedelijke recombinante plasmiden in een kolonie
nagegaan. Daarvoor worden de recombinante plasmiden eerst geïsoleerd en later onderworpen aan
spectrofotometrische DNA-concentratiebepaling. Een gelijke hoeveelheid DNA kan zo als controle
geanalyseerd worden op de gel.
,De gekloneerde 493 en 784 bp λ-DNA-fragmenten, uit pGEM-3Zf(+)-HB493 en pGEM-3Zf(+)-HB784,
dienen als probe-fragment voor het bereiden van een gelabelde probe in Southern blot analyse. De
recombinante plasmiden ondergaan een restrictie-digest met BamHI en HindIII, gevolgd door een
preparatieve gelektroforese en fragmentzuivering om de gewenste probe-fragmenten te verkrijgen.
Een fluorimetrische analyse van de opgezuiverde fragmenten volgt om de DNA-concentratie te
bepalen.
Als laatste wordt het genomisch DNA van faag λ (48502 bp) verknipt met verschillende combinaties
van de restrictie-enzymen EcoRI en HindIII. Na agarosegel elektroforese zal de gel getransfereerd
worden via capillaire blotting naar een positief geladen nylon membraan om specifieke DNA-
sequenties te detecteren via Southern blot analyse. Specifieke genomische DNA-sequenties en
zelfgemaakte 493 bp of 784 bp digoxigenine-gelabelde probes zullen worden gehybridiseerd. Deze
hybridisatie zal gevisualiseerd worden met behulp van anti-DIG antilichamen.
2 Principe [1]
Kloneren
De λ DNA-fragmenten en de vectorfragmenten ondergaan elk hun eigen preparatieve
agarosegelektroforese, zodat ze op een andere gel kunnen worden geladen en dus op een andere
manier kunnen worden gevisualiseerd. De agarose concentratie in de gel voor de gelelektroforese van
pGEM-3Zf(+) fragmenten is 0,5% lager dan in de gel voor λ DNA framenten, omdat deze kleinere λ
DNA-fragmenten zo dus een snellere mobiliteit hebben dan de pGEM-3Zf (+) fragmenten en dus zo
beter scheiden.
Bij fragmentopzuivering van de pGEM-3Zf(+) vectorfragmenten uit de agarosegel,snijden we een
geldeel uit de gel die een klein gedeelte van de lanen met de gescheiden pGEM-3Zf(+)
vectorfragmenten en de fragmenten van de merker 1kb DNA ladder bevat. Achteraf wordt dit gel
gedeelte gekleurd met Fast Blast DNA stain. De Fast Blast DNA Stain kan hier gebruikt worden, omdat
de lage hoeveelheid binding per aantal baseparen geen probleem vormt bij de kleuring van het grote
vectorfragment van 3167 bp. Fast Blast DNA Stain is veiliger om te hanteren en verlaagt het risico op
DNA-beschadiging door UV-belichting. Het DNA zal makkelijker gekleurd worden door het lagere
agarosegehalte van de gel. De migratieafstand van de gescheiden pGEM-3Zf(+) vectorfragmenten
wordt vergeleken met de migratieafstand van de merker 1kb DNA ladder. Nadat het uitgesneden
gekleurde geldeel teruggeplaatst wordt, kunnen de overige niet-gevisualiseerde 3167 bp-fragmenten
worden geïsoleerd.
De door BamHI en HindIII verknipte λ-DNA- en pGEM-3Zf(+)-fragmenten worden na de preparatieve
agarosegelelektroforese ook opgezuiverd. Hiervoor wordt een zo minimaal mogelijk geldeel, dat het
gedeelte van de lanen met de gescheiden λ-DNA-fragmenten en de fragmenten van de merker 1kb
Plus DNA ladder bevat, uitgesneden en gekleurd via GelRed. GelRed voegt zich tussen de baseparen
en zal zo oranje-rood fluoresceren onder UV-belichting. De migratieafstand van de gescheiden λ-DNA-
fragmenten wordt vergeleken met de migratieafstand va de merker, 1kb plus DNA ladder. De nodige
fragmenten worden uitgesneden, waarna het gekleurde geldeel wordt teruggeplaatst zodat de
overige niet-gevisualiseerde fragmenten van 784 bp en 493 bp kunnen worden uitgesneden. Voor de
opzuivering wordt gebruik gemaakt van de PureLink® Quick Gel Extraction Kit. De techniek is
gebaseerd op het verdringen van water op de silicamembraan door middel van een hoge
,zoutconcentratie om vervolgens de binding van de negatief geladen DNA-fragmenten te bevorderen.
De ongebonden fragmenten worden weggewassenen, isopropanol zorgt dan op zijn beurt voor een
versterkte binding van de DNA-fragmenten met de kolom. De DNA-fragmenten worden met behulp
van de elutiebuffer van de membraan verwijdert.
Bij de fluorometrische bepaling van de DNA concentratie wordt er gebruikt gemaakt van de
fluorometer. Zo wordt er op een sensitieve en specifieke manier, de concentratie van het kleine
volume van het opgezuiverde DNA-fragment bepaald. Er wordt gebruik gemaakt van een
kleurstofmolecule die specifiek aan dubbelstrengig DNA kan binden. Dit is echter mogelijk door aan
de stalen een working solution toe te voegen. De gebonden kleurstofmoleculen worden door licht met
een bepaalde golflengte geëxciteerd. De kleurstofmoleculen keren dan terug naar een stabielere
toestand, met als gevolg warmteafgifte en geëmitteerde fluorescentielicht met een hogere
golflengte. Dit licht wordt gedetecteerd door een fotodetector en zo kan de DNA-concentratie
kwantitatief bepaald worden van een staal met een gekend volume. Het voordeel van deze techniek
is dat contaminatie van het staal geen probleem is en accuraat is voor een brede range van
staalconcentratie. Een nadeel van deze techniek is dan weer dat er geen details worden
weergegeven over de onzuiverheden en dat het aanschaffen van een Qubit® fluorometer duur is.
Het door PstI verknipte λ-DNA, dat dient als DNA-merker, wordt geëvalueerd door middel van een
agarosegelelektroforese, dit is een scheidingsmethode waarbij DNA moleculen op basis van grootte
van elkaar worden gescheiden. De migratieafstand van de verknipte λ-DNA-fragmenten wordt
vergeleken met de migratieafstand van de 1kb plus DNA ladder. Bij een positieve resultaat wordt de
λ-DNA-merker mee opgenomen als standaardreeks bij de DNA-concentratie. De intensiteit van de
fragmenten wordt met de intensiteit van de fragmenten van de standaardreeks vergeleken. Indien de
intensiteit vergelijkbaar is, wijst dit op een vergelijkbare hoeveelheid DNA. DNA-concentratiebepaling
is mogelijk, omdat de hoeveelheid DNA binnen het fragmentenpatroon van de standaardreeks en het
geladen volume van de opgezuiverde DNA-fragmenten gekend is. Een nadeel is hier dat de resultaten
semi-kwantitatief zijn en de techniek arbeidsintensief is. Een voordeel bij deze techniek is dat er RNA
contaminatie gedetecteerd kan worden en dat er ook iets te weten wordt gekomen over de grootte
van de fragmenten.
Ook via een spectrofotometrische analyse zal de DNA-concentratie bepaald worden in het
experiment. De nucleïnezuren in de DNA-oplossing absorberen UV-licht bij een golflengte van
260nm. Hoe hoger de concentratie aan nucleïnezuren, hoe meer absorbantie van UV-licht door een
UV-spectrofotometer. Via deze analyse is er een mogelijkheid om de zuiverheid van het DNA-staal na
te gaan. Eiwitten, RNA en buffercomponenten vertonen absorptie in dezelfde range van golflengtes
als nucleïnezuren. Daarom zal de A 260nm/A280nm verhouding toegepast worden. De ratio van een
zuivere DNA-oplossing bedraagt 1,8. Al is dit een veronderstelling, er mag nooit zomaar er vanuit
gegaan worden dat bij een resultaat van 1,8 dit sowieso zuiver DNA is. Een hogere ratio dan 2,0 wijst
op RNA-contaminatie en een lagere ratio dan 1,7 wijst op eiwittenverontreiniging. De voordelen van
deze analyse zijn dat de concentratie snel en eenvoudig te bepalen is en dat er maar een laag
volume aan staal nodig is. Het nadeel van deze analyse is dat er vaak een overschatting plaats vindt
aangezien DNA niet het enige type molecule is dat UV-licht absorbeert bij 260 nm.
, Ligatie
Het T4 DNA ligase-enzym gaat ervoor zorgen dat twee moleculen met elkaar verbinden. Met andere
woorden, dat er een ligatie gaat plaats vinden. Door dit ligasen zal het gezuiverd 493 bp- of 784 bp
DNA-fragment geïntroduceerd worden in de gelineariseerde vector pGEM-3Zf(+) van 3167 bp. T4
DNA ligase katalyseert de vorming van een fosfodiësterverbinding tussen 3’-OH en 5’-P in
dubbelstrengig DNA . Het resultaat van deze ligatie is een recombinant plasmide dat later in
competente E. coli cellen kan geïntroduceerd worden.
Het gebruik van de twee restrictie-enzymen creëert niet-compatibele kleverige uiteinden en sluit
zelfsluitende vectoren uit. Een 1:1 molaire vectorfragment zal worden gebruikt om de ligatie-
efficiëntie te verhogen, inclusief het voorkomen van multimere inserts.
Bereiden competente E.coli en transformatie met selectie van AmpR kolonies
Competente cellen zijn cellen die in staat zijn om exogeen DNA op te nemen en verder te laten
vermenigvuldigen. E.coli doet dit vanuit nature heel beperkt. Daarom worden deze cellen competent
gemaakt door middel van een fysische en/of chemische behandeling. Namelijk de CaCl 2-methode.
Het tweewaardig kation Ca2+ zal verhinderen dat negatief geladen DNA afgestoten wordt door de
negatief geladen macromoleculen op het celmembraan van de E. coli. Verder gebeurt een incubatie
op ijs voor de membraanstructuren te stabiliseren en de Ca 2+-interacties te bevorderen. Het
competent maken van E. coli cellen is nodig zodat deze de recombinante plasmiden kunnen
opnemen of transformeren.
Door gebruik te maken van een hitteshock, een plotse stijging van de tempratuur, verandert de
doorlaatbaarheid van de celmembranen. De vloeibaarheid van de semi-kristallijne structuur van het
binnenste en buitenste membraan veranderd. Hierdoor ontstaat er door een soort van fusie,
namelijk, membraan kanalen. Waardoor het transport van exogeen DNA door het membraan
mogelijk wordt en het exogeen DNA zo in staat is om in de E.coli cel terecht te komen.
De selectie van getransformeerde E. coli cellen is gebaseerd op de aanwezigheid van een selectief
markeringsgen van de vector. Het expressiegen codeert voor bèta-lactamase dat de bèta-lactamring
van het antibiotica Ampiciline af breekt. E. coli cellen die in staat zijn te leven op een medium met
Amp hebben de recombinante plasmiden opgenomen en zijn daarvoor ampiciline resistent (Amp R).
Cellen met niet-opgenomen recombinante plasmide groeien niet op dit medium.
Opsporen van E. coli met recombinant plasmide
Kolonie PCR zal nagaan of er effectief een aanwezigheid is van het insert-DNA in het recombinant
plasmiden (in de kolonie op de voedingsbodem). De getransformeerde E. coli cellen die AmpR
vertonen kunnen rechtstreeks vanuit een kolonie gehaald worden zonder de behoefte het
recombinante plasmide DNA op te zuiveren uit de cellen. Aan deze kolonies worden dNTP’s, primers
en het Taq-polymerase toegevoegd. Door de eerste denaturatiestap, met een hoge
denaturatietemperatuur wordt de bacteriële cel gelyseerd, waardoor het template DNA vrijkomt.
Twee verschillende primerparen met een annealingstemperatuur van 60°(LVH1-FwpGEM3Zf+ en
LVH2-RvpGEM3Zf+) en 50°C (LVH3-FwT7 en LVH4-RvSP6mod) worden in deze kolonie PCR
aangewend. Voordelen van deze primer zijn dat ze iets kunnen vertellen over de beoogde
moleculaire grootte van het insert en of het insert al dan niet is opgenomen in het plasmide. Dit
