H1: Isolatie en visualisatie
nucleïnezuren
1. Inleiding
G en C: 3 H-bruggen A en T: 2 H-bruggen
Atomische modificaties isotopisch labelen
(emitteren β-straling): 31P 32P/33P, 14N
15N, 12C 13C/14C, H 3H
Bij DNA-replicatie: desoxyribonucleotidetri-P
molecule wordt herkend obv template strand
chemische reactie met vrijstelling pyrofosfaat
DNA-polymerase kan geen 5’ uiteinde verlengen
Hershey & Chase (1952): enkel DNA van faag gaat in cel DNA bevat alle info nodig voor
reproductie van nieuwe bacteriofaagpartikels
2. Isolatie van nucleïnezuren
Globale doelstellingen van gentechnologische bewerkingen:
1. EXPLORATIE: analyse van genoom en signalen
Prenatale diagnose, microbiologische analyses, virusidentificatie
2. GEBRUIK: expressie van eiwit in grote hoeveelheid
Industriële productie (interferonen, insuline, agarose, amylase)
3. DESIGN: gerichte wijziging van organisme in omgeving
Biotechnologie: inbouw nieuwe eigenschappen
Middelen voor isolatie:
Inhibitie biochemische activiteiten Snelle verwijdering nucleïnzuur van rest
- EDTA - Fenol, chloroform
- Temperatuur verlagen - Gebruik ethanol, isopropanol, PEG,
- Eiwitdenaturerende agentia spermidine, CTAB
toevoegen - Qiagen, Glassmilk (dragers waarop
nucleïnezuur bindt)
Guanidiumzouten DEPC (di-ethylpyrocarbonaat)
Chaotroop agens: vernietingt 3D-structuur Sterk alkylerend agens
guanidium HCl: sterke inhibitor RNase ethoxyformylering van histidylgroepen
guanidiumisothiocyanaat: nog sterker behandeling glaswerk en oplossingen
VRC (vanadylribonucleoside complex) Proteïne-inhibitoren van RNase
bindt aan actieve plaats RNasen en uit cytoplasma van bijna alle
inhibeert katalytische activiteit zoogdierweefsels
gebruikt bij mRNA isolatie voor cDNA RNAsin, prime inhibitor
klonering
1
, A. Bereiden van bacterieel DNA
1. Nood aan voldoende biomassa groeimedium met
bacteriën
2. Cel lysis cel extract
3. Centrifugatie cell pellet (precipitatie) verwijderen
DNA, RNA en proteine in suspensie
4. Celextract mengen met phenol scheiden in 2 lagen na
centrifuge (fenol is zwaarder) DNA in suspensie,
proteinen op interface
Cellysis met E. coli als waardcel:
A. Cleared lysate methode
1. EDTA + lysozyme + 25% sucrose toevoegen aan cel
EDTA vormt complex met ionen destabiliseren
buitenmembraan
Lysozyme breekt peptidoglycaanlaag af
Bacteriecel spat niet uiteen door 25% sucrose
2. Triton X-100 toevoegen aan sferoplast (geeft prikje aan cel) celextract
3. Centrifugeren troebele zone heeft DNA (supercoiled en open-circular) + lysaat heeft
plasmiden
B. Alkalische lysis methode (plasmide opzuivering)
1. Op en neer pipetteren chromosomaal DNA breekt in stukken (lineaire DNA
fragmenten + supercoiled plasmide)
2. Bij pH 12: chromosomaal DNA denatureert single stranded
3. pH 7: DNA-fragmenten vinden elkaar niet terug niet-georganiseerde massa
4. Centrifuge pellet van lineaire DNA-moleculen + plasmiden in oplossing
C. Kooklyse
Ruwe procedure cellen barsten open door verhitting
D. Fenollyse
Alternatieve zeer ruwe methode (enkel geschikt voor snelle karakterisatie)
B. Opzuivering van faag DNA
Fagenpartikels zijn te klein, blijven in suspensie cellen en debris precipiteren
1. Faagsuspensie PEG + zout toevoegen faagpartikels precipiteren
2. Centrifuge onzuiverheden in suspensie verwijderen dichtheidgradientcentrifugatie
3. CsCl in kolom gedeponeerd in verschillende conc gelaagdheid
4. Faagpartikels volgen densiteit en gaan op specifieke densiteit stabiliseren (afhankelijk van
verhouding eiwit/DNA) faagpartikels opzuiveren
C. CTAB methode voor isolatie plant DNA
Extratie DNA aan hoge kwaliteit waarbij minimaal DNA wordt gebroken
1. CTAB, TrisHCl, EDTA, NaCl, BME en proteinase K toevoegen aan celextract
2. CTAB treedt in complex met nucleinezuren en precipiteert (bij lage zoutconc)
3. Centrifuge (nucleinezuur-CTAB in pellet) supernatans verwijderen
4. Resuspenderen aan hoge zoutconcentratie DNA terug in oplossing
5. DNA zuiveren door eenvoudige stappen
D. DNA opzuivering
2
, A. Geconc DNA-oplossing met absolute ethanol ethanol opleggen DNA precipitatie op
interface met glazen staaf isoleren
B. Aan 1 volume DNA 2.5x zoveel ethanol toevoegen in zoutomstandigheden DNA
precipiteert resuspenderen in volume naar keuze
C. Silicapartikels die door guanidium thiocyanaat (GTC) binden aan DNA silica in kolom
celextract erover biochemische molecules elueren toevoegen water DNA in apart
recipient
D. IEX met + partikels interageren met – DNA zout toevoegen RNA vrij van kolom
hoge zoutconcentratie DNA komt vrij
Conventionele anion-exchangers: DEAE kern die gekoppeld is aan suikermolecules (20 A
uit elkaar): + lading die interageert met P-backbone
Verbeterde anion-exchangers: afstand DEAE dichter bij elkaar
E. Spectrofotometrische zuiverheidsbepaling van nucleïnezuren
Snelle, niet destructieve meting van nucleïnezuren
Geen onderscheid tussen DNA en RNA (RNase-vrij DNa om contaminerend DNA te
verwijderen)
Verhouding absorbantie 260/280 nm zuiverheid DNA en RNA bepalen
Ratio van 1.8 Zuiver DNA
Ratio van 2.0 Zuiver RNA
Ratio < 1.8 Eiwit, fenol of andere contaminanten
3. Scheiding en detectie van nucleïnezuren
A. Agarose gelelectroforese
PARAMETERS DIE MIGRATIESNELHEID BEÏNVLOEDEN:
1. Agaroseconcentratie
alternerende D- en L-(3-6-anhydro)galactose, gekoppeld door a(1-3) en b(1-4)
glycosidische bindingen vormt 3D-structuur
INVERS LINEAIR VERBAND TUSSEN LOG ELEKTROFORETISCHE MOBILITEIT EN
GELCONCENTRATIE
2. Moleculaire grootte
MIGRATIESNELHEID IS OMGEKEERD EVENREDIG MET LOG RELATIEVE MOLECULAIRE
MASSA
Voor grote DNA-fragmenten: hogere resolutie voor lage densiteit
3. Conformatie DNA
Supercoiled is kleiner dan genikte open circulaire sneller door matrix
Ethidiumbromide: lading daalt; DNA minder flexibel en langer
4. Aangelegde voltage
Typisch 5 volt per cm lengte van de gel
Hoe hoger voltage, hoe harder DNA trekt naar + kant
Te hoog: warmteproductie die gel doet smelten (minder zuiver)
Low melting agarose: door hydroxy-ethylatie
Metaphor agarose: hogere resolutie (kleinere fragmenten)
1. DNA scheiden door GE gewenste fragment uitsnijden met scalpel
2. Agarose oplossen + mengen met silica dat chaotropisch zout bevat
3. DNA bindt aan silica matrix onzuiverheden verwijderd door eenvoudige wasstappen
3
, 4. DNA elueren uit matrix door buffer met lage zoutconcentratie
B. Staining DNA
Intercalatie in ds-DNA is redelijk stabiel: verwijdering door diffusie is moeilijk extractie met
butanol & iso-amylalcohol of via IEX
Ethidium bromide SYBR SYBR gold
Intercaleert tussen basenparen Asymmetrische cyanine kleur Relatief duur
Specifiek absorbantie en Geen fluorescentie in - gevoelig aan fluorescent licht
emissiespectrum oplossing, wel bij binding aan - gouden kleur
DNA/RNA
Staining: DNA in een gel bad in Gevoeliger dan EtBr: - 10x meer gevoelig
buffer met EtBr fixatie in - niet fotostabiel - redelijke gelpenetratie
DNA & nabijheid baseringen - slechte gelpenetratie - bindt mogelijk aan
verhogen fluorescentie - niet optimaal bij 300nm fosfaatruggengraat sterke
Toegevoegd wanneer gel vertraging en beïnvloeding van
wordt gegoten (vertraagd mobiliteit
migratiesnelheid + minder
duidelijke bandjes)
Destaining: in water of 1 mM
MgSO4
Zorgt voor foto-oxidatie van
DNA bij licht en O2
Mutagene stof
Bindt ook ss nucleinezuren
zwakkere fluorescentie
C. Gelvrije detectie van nucleinezuren
Microfluida, CE en fluorescente kleurstoffen RNA/DNA concentratie en integriteit bepalen
Heel gevoelig + precies
D. Pulsed-Field Gel Electrophorese (PFGE)
Grote fragmenten scheiden tot 10 Mb
Grote DNA-molecules ontrafelen en bewegen als slang doorheen gel
Hoe groter molecule, hoe moeilijker herorientatie
1. Elektrisch veld leggen op A molecule migreert naar rechtsboven (beweegt als slang)
2. Stroom stilleggen stroom over B DNA herorienteert en beweegt naar links
3. Herhaling vorming zigzagbeweging
PROBLEEM: fysisch lange, grote moleculen leggen fysische stress op en kunnen
breken cellen worden gelyseerd terwijl ze in agarose zitten, daarna rechtstreekse
scheiding
E. Immobilisatie van nucleïnezuren
Northern blot (RNA)/ Southern blot (DNA)/ Western blot (proteïne)
Afdruk en immobilisatie op cellulosenitraatmembraan kunnen versterkt worden met
polyester nylonmembranen
Capillaire transfer electro-blotting vacuumblotting
4
