Celbiologie I (F. Claessens)
H1: DNA, DEOXYRIBONUCLEIC ACID
1.1 Inleiding
CENTRALE DOGMA VAN MOLECULAIRE BIOLOGIE
-> DNA (kenmerken) REPLICATIE -> RNA (boodschap) TRANSCRIPTIE -> proteïne TRANSLATIE
1.1.1 Biochemische definitie van leven
LEVEND ORGANISME
- Afgescheiden van zijn omgeving/ andere chemische samenstelling
- Energie-opname (eten/drinken/zonlicht) en -verbruik
- Zelfstandige beweging
- Voortplanting: kenmerken doorgeven (uitzondering: onvruchtbare individuen en kristallen/robots)
- Interpretatie van prikkels: organisme reageert op veranderingen in omgeving
- Communicatie (ook bv. eten of gegeten worden, darmflora, effect bijensterfte op fruitoogst) = biodiversiteit
- Groei: organisme evolueert met de tijd (niet voldoende definitie, bv. kristal groeit ook)
- Biomolecules (specifieke chemische verbindingen) --> proteïnen, lipiden, polysachariden, nucleïnezuur
1.1.2 Waaruit bestaat een levende cel?
- cel = eenheid van het leven (min of meer autonoom in staat om te ‘overleven’)
- wisselwerking tussen biomoleculen: proteïnen, lipiden, carbohydraten en nucleïnezuren
- info opslaan -> doorgeven en tot expressie brengen
- Eukaryoot (kern, compartimenten) ≠ Prokaryoot (geen kern, meestal ziektekiemen), wel zelfde mechanismen
1.2 Belangrijkste mijlpalen in de geschiedenis van de erfelijkheidsleer
1.2.1 Eigenschappen zijn erfelijk: de genen
= elementen die info bevatten over karakteristieken/soort van een individu, coderen voor erfelijke eigenschappen
1.2.2 Erfelijkheidsleer Mendel (erwten)
- Definitie van genen (2 gekoppelde per kenmerk, eventueel meerdere allelen, diploïd -> 1 doorgeven aan volgende generatie)
- Kenmerken zijn intermediair/dominant/recessief
1.2.3 Link genen en biochemische processen van Garrod
- Wetten van Mendel zijn ook toepasbaar op de mens
- Ziekte alkaptonurie (zwart babypipi, opstapeling homogentisinezuur…) -> oorzaak: defect gen -> zit in de familie (recessief)
- Erfelijkheid van (defecten in) biochemie
1.2.4 Welke stoffen bevatten de genetische informatie?
- Men dacht dat chromosomen (eiwitten) de kenmerken doorgaven -> want celdeling: chr. verdeeld over dochtercellen
1.2.4.1 Componenten isoleren uit cellen
A. ‘Stukmaken’ --> doel: HOMOGENAAT (mengsel)
- Mechanisch (breken/knippen/…)
- Sonicatie (m.b.v. ultrasone geluidsgolven celwanden breken)
- Detergent (celmembranen oplossen)
B. Mengsel scheiden
Differentiële ultracentrifugatie:
1. Cellen stukmaken
2. Mengsel filtreren -> grote brokstukken verwijderen
3. Lage rotatie-snelheid -> middelpuntvliedende kracht > zwaartekracht
-> zwaarste organellen onderaan = pellet ( bovenliggende oplossing = supernatans)
4. Supernatans overgebracht in nieuwe centrifugebuis -> hogere rotatie-snelheid (deze stap blijven herhalen)
(*opmerking: 50.000 rotaties/min --> g-krachten tot 300.000 maal zwaartekracht)
Densiteitscentrifugatie:
1. Sucrosegradiënt aanbrengen (of CsCl-oplossing) -> onderaan grootste densiteit
2. Homogenaat bovenop deze gradiënt aanbrengen
3. Centrifuge op hoog toerental -> organellen blijven hangen op laag die overeenkomt met hun eigen densiteit
4. Lagen eruit halen (met spuit leeg/ laten lopen/…)
1.2.4.2 Het experiment van Griffith (1941)
- Salmonella Premmosia (testen op muizen) -> 2 stammen vergeleken: S en R
- S-stam (dodelijk, indien levend) en R-stam (niet dodelijk)
- Verhitte S + R -> wel dodelijk -> transformatie: bacteriën kunnen dragers van eigenschappen/genen uit omgeving opnemen
- Experiment: R + eiwit/lipide/RNA/DNA/koolwaterstoffen van S -> enkel mengsel met DNA zorgde voor dodelijke eigenschap
-> DNA = drager kenmerk!
1
,1.2.4.3 Het Hershey-Chase experiment
- Bacteriofagen = virus bacteriën (DNA + eiwitten)
- Bacteriofaag + bacterie (bv. E. Coli) --> heel veel bacteriofagen
- Bacteriofaag + E. Coli -> schudden -> centrifugeren -> pellet met bacteriën in voedingsboden:
bacteriofagen gevormd, want kenmerk al doorgegeven
- Experiment: radioactief fosfaat -> DNA bacteriofagen = radioactief
radioactief zwavel -> eiwit bacteriofagen = radioactief
E. coli + gelabelde bacteriofagen -> fosfor in pellets (dus DNA is doorgegeven) -> DNA = drager kenmerk!
1.3 De structuur van het deoxyribonucleïnezuur (DNA)
1.3.1 DNA = suiker + fosfaat + basen
- twee vormen: DNA en RNA
- DNA < lange polymeren
- (β-D-2-)deoxyribose (suiker): koolstoffen genummerd?? Fig. 2.10 -> C3’ is C gebonden aan OH
- fosfaatgroepen: ruggengraat DNA, gebonden aan 5’ uiteinde deoxyribose
- basen: purines (adenine, guanine) en pyrimidines (thymine, cytosine) -> stikstof-bevattende ringstructuren
- N-β-glycosidische binding tussen base en ribose -> nucleoside: C1 suikerrest gebonden aan N9 purine en N1 pyrimidine
(aan adenine -> adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), thymidine (T) en aan uracil -> uridine (U))
- nucleotide: fosfaatgroep aan 5’ koolstof (via fosfo-anhydridebindingen) -> α-, β- en γ-fosfaatgroep
3 fosfaatgroepen -> dNTPs = deoxyribonucleotide-tri-fosfaten
ribose niet gedeoxyleerd -> NTPs = nucleosidetrifosfaten (bv. ATP -> ‘fosfaatenergie’)
- ribosen verbonden via fosfodiesterbindingen: 5’ koolstof ribose via fosfaatgroep aan 3’ koolstof vorige ribose
1.3.1.1 Andere belangrijke basen en nucleotiden
- cyclische vormen mononucleotiden: signaalmoleculen -> cNMP (bv. adenosine -> cAMP)
- coenzyme A, NAD en FAD
- basen en eiwitten op intracellulair niveau gemethyleerd
- purine- en pyrimidine-analogen: bv. caffeïne inhibeert fasfodiesterasen (cAMP -> AMP) -> effect AMP versterkt
- AZT/Tenofovir: behandeling AIDS, inhibeert enzyme voor replicatie hiv-virus
1.3.2 Eigenschappen van DNA
1.3.2.1 Het model van de β-helix
- Regels van Chargaff: relatieve hoeveelheden basen in genomisch DNA van een soort is constant, ook is [A]=[T] en [G]=[C]
- Rosalind Franklin: X-straaldiffracties -> DNA-structuur is helicaal
- DNA: dubbelstrengige, anti-parallele structuur -> dubbele helix
A=T en C≡G associëren via waterstofbruggen -> complementaire basenparen loodrecht op fosfaatruggengraat
fosfaatgroepen naar buitenkant gericht (hydrofiel)
β-helix: grote- en kleine groeve, o.w.v. niet-diametrale ligging glycoside-bindingen
andere mogelijkheden: Z-DNA en tripel-helix (komen niet vaak voor)
- stabiliteit DNA: grote aantallen basen, van der Waals krachten en stapeling basen
- strengen uit elkaar door bv. temperatuurstijging
1.3.2.2 Notatie basenvolgorde
bovenste streng van 5’ naar 3’, andere is complementair en hoeft niet genoteerd te worden
bv. 5’-AGGGTTTACACATT-3’
3’-TCCCAAATGTGTAA-5’
1.3.2.3 Palindromische sequentie
- taalkundig: palindroom = woord dat in beide richtingen hetzelfde gelezen wordt
- DNA: enkel onderste streng (die we van rechts naar links lezen) is een palindroom???
1.3.2.4 Hoe kan DNA bestudeerd worden?
Absorptie:
- DNA absorbeert UV-licht (260nm), absorbtiewaarde = 1,0
- dubbelstrengig DNA absorbeert minder dan enkelstrengig DNA
- absorptie in functie van temperatuur: grafiek stijgt vanaf smelttemperatuur tot een plateauwaarde = hyperchromiciteit
Hybridisatie: DNA denatureren en vervolgens terug laten afkoelen -> DNA strengen vinden elkaar terug en hybridiseren
DNA elektroforese:
- gebruikt om: DNA te bekijken, DNA moleculen van verschillende lengte te scheiden en DNA fragmenten op te zuiveren
- DNA is neg. geladen -> migreert naar pos. pool doorheen agarosegel*-netwerk (lange fragmenten minder ver dan korte)
- DNA zichtbaar maken met Ethidiumbromide** (of bv. SYBRSafe***) -> fluoresceert (oranje) indien absorptie UV-licht
- DNA scheiden met scherp mesje, vergelijken met DNA van gekende lengte -> lengte fragment extrapoleren
*polysachariden, onderling verbonden door H-bruggen, oorspronkelijk uit zeewier ** planaire stof *** minder kankerverwekkend + blauw licht
2
, H2: DNA REPLICATIE
2.1 Replicatie is semi-conservatief
DNA replicatie: genoom van E. Coli -> 4,5 . 106 basenparen
menselijk genoom -> 3,3 miljard basenparen, diploïd -> 6,6 . 109 basenparen --> getallen kennen!!
Theoretisch gezien 3 opties:
A. semi-conservatieve deling -> half-bewarend, strengen uit elkaar, helft
doorgegeven en andere helft gemaakt
B. conservatieve deling -> dubbelstreng geconserveerd
C. dispersieve deling -> verdeeld over DNA strengen worden stukjes nieuw
DNA toegevoegd -> steeds meer verdund
Welke is juist?
-> experiment met E. Coli (voordeel: snelle deling)
1. E. Coli bacteriën kweken, stukmaken en scheiden op CsCl-gradiënt -> DNA op plaats waar densiteit DNA = densiteit CsCl (14N)
2. E. Coli kweken en enkel 15N geven -> DNA heeft hogere densiteit (lager in gradiënt)
3. E. Coli 15N brengen in 14N voor één generatie lang -> DNA heeft densiteit tussen 1. en 2. in
4. E. Coli 15N brengen in 14N voor twee generaties lang -> twee densiteit ‘banden’ in CsCl-gradiënt
-> Enkel semi-conservatieve voldoet aan de experimentele constataties!
2.2 DNA-polymerase
- kunnen dNTPs binden aan DNA (3’OH-uiteinde nodig!) --> 5’-3’-pol.
- onomkeerbaar proces
- maakt fouten: bv. foute base -> foute (B-)helicale structuur -> komt op foute plaats terecht, waar de binding verbroken wordt
= proofreading/’nalezen’ van 3’ naar 5’
Herstel DNA polymerase:
3 functies: 5’-> 3’ exonuclease
5’-> 3’ polymerase
3’-> 5’ proofreading (= exonuclease activiteit)
2.3 Replicatievork
EN foto’s DNA replicatie -> bubbels zichtbaar
= splitsingspunten
= replicatievork,
hier gebeurd DNA synthese:
1. DNA uiteen door helicase (zie cursusblad) -> ringstructuur, gebruikt ATP (E) om over het DNA te schuiven
2. Topoisomerase -> veranderen topologie, maar behouden structuur (als oplossing voor warrig netwerk dat ontstaat na stap 1.)
a. Topo I -> binding DNA strengen op één punt losgemaakt, superbinding draait -> stilstand -> terug gebonden
b. Topo II -> X-structuur -> knipt GR-S (ATP) -> O-structuur -> G-S naar beneden -> GR-S terug sluiten -> G-S zit achter GR-S
-> -> -> -> -> -> ->
--> geneesmiddel: novobiosine, inhibeert werking topo II, verhindert dat ‘blauwe’ streng terug kan sluiten
--> topo I inhibitor: camptothecin, behandeling kankercellen
3. SSBP -> single stranded binding proteins, beschermen het enkelstrengig DNA tegen afbraak
4. (RNA polymerase) primase -> primer, maakt 3’OH-uiteinden
5. DNA polymerase -> (DNA pol III voor E. Coli en DNA pol δ bij eukaryoten) DNA aanmaken in 5’-3’ richting
6. Sliding clamp -> ringstructuur rond DNA, houdt DNA polymerase op z’n plaats
7. DNA polymerase -> RNA primers vervangen door DNA, er blijven nog nicks (openingen) tussen de fragmenten
8. Ligase: uiteinden van nicks aan elkaar plakken
2.4 De replicatievork is asymmetrisch
LEADING STRAND: 5’ – 3’ streng -> snelle replicatie
LAGGING STRAND: 3’ – 5’ streng, er moet telkens een nieuwe primer aangebracht worden -> bestaat uit okazaki fragmenten
RNA verwijdert door polymerase I (bij prokaryoten) en herstel-polymerase (bij eukaryoten)
3
