Sumario Avances en Técnicas de Diagnóstico Molecular: Enfoque en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
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Course
Biologia Cel·Lular
Institution
Universitat De Barcelona (UB)
Este documento explora a fondo la utilidad y los avances de la técnica de PCR en el ámbito del diagnóstico molecular. Se abordan temas clave como la amplificación de ADN, pruebas diagnósticas, y su relevancia en la biología molecular. Ideal para aquellos interesados en la tecnología médica ...
La PCR, acrónimo de la reacción en cadena de la polimerasa, revolucionó el campo del diagnóstico molecular, hasta
el punto de que en la actualidad representa el segmento de mayor crecimiento en los laboratorios clínicos del mundo entero,
en los que se ha convertido en herramienta de invaluable utilidad. El presente escrito describe los fundamentos de la
metodología, así como algunas de sus múltiples aplicaciones en la diagnosis, desde sus albores hasta el presente.
Palabras clave: PCR; Métodos; Utilización; Historia.
Polymerase chain reaction and molecular diagnostics
SUMMARY
PCR, acronym of polymerase chain reaction, has revolutionized the field of molecular diagnostics to the point that it
currently represents the fastest-growing segment in clinical laboratories worldwide, where it has become an invaluable tool.
This paper describes the fundamentals of PCR and its developments in some of its many applications in the diagnosis, from
its beginnings to the present.
Keywords: PCR; Methods; Utilization; History.
Hace cerca de 25 años hizo su aparición la reacción recombinante de los plásmidos o de los vectores que
en cadena de la polimerasa (PCR), metodología encami- antes se habían transferido en microorganismos, usual-
nada a obtener cantidades grandes de ADN para su mente bacterias. En 1970 se habían descubierto las
utilización en el laboratorio clínico. Este evento tuvo endonucleasas de restricción, enzimas bacterianas que
lugar en forma más o menos reciente, si se considera que cortan el ADN en sitios específicos6,7. Estas enzimas,
desde 1953 se habían descrito, tanto la estructura doble más conocidas como enzimas de restricción, fueron
hélice de la molécula de ADN como las reglas de claves en el éxito de la nueva tecnología, pues gracias a
complementariedad que la rigen1, y de haberse logrado ellas, el ADN de interés se podía aislar e insertar en un
avances importantes en comprender los procesos de vector determinado, con el fin de formar moléculas
transcripción de los ácidos nucleicos y traducción en recombinantes de ADN. A pesar de sus múltiples apli-
proteínas de los organismos eucarióticos2-5. caciones, entre las que se encuentran la obtención de
Con antelación al advenimiento de la PCR y ya en los cantidades grandes de proteína pura, la identificación de
albores de la década de 1970, la tecnología del ADN mutaciones, la identificación del estado portador de
recombinante era la única forma posible de estudiar la enfermedades hereditarias, la transferencia de genes de
estructura y función de los genes eucarióticos. No un organismo a otro y el mapeo de genes en los
obstante lo dispendiosa, esta tecnología tuvo la ventaja cromosomas, lo tedioso de la tecnología del ADN
de permitir el aislamiento de cantidades relativamente recombinante hizo que muchos investigadores pensaran
grandes de ADN puro, producto de la replicación que, en opciones diferentes, que también ofrecieran la ventaja
durante la división celular, se efectuaba en el ADN de recuperar cantidades grandes de ADN.
1. Profesora Asistente, Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad del Rosario, Bogotá DC, Colombia.
e-mail: victoria.villegasga@urosario.edu.co mcsanche@urosario.edu.co
2. Profesora Principal, Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad del Rosario, Bogotá DC, Colombia.
e-mail: lchuaire@urosario.edu.co
Recibido para publicación marzo 18, 2009 Aceptado para publicación julio 1, 2009
Mecanismo de la PCR Hacia 1983, esa inquietud llevó a Kary Mullis, en ese
entonces investigador de la Cetus Corporation de
La reacción en cadena de la polimerasa es en Emeryville, California, a desarrollar un método simple
realidad un sistema que permite obtener - en para la obtención un número ilimitado de copias de una
pocas horas‐ varios millones de copias de una secuencia específica de ADN en un tubo de ensayo. Su
secuencia blanco de ADN. La reacción se lleva objetivo consistía en analizar una mutación responsable
de una enfermedad genética humana, para lo cual traba-
a cabo dentro de un tubo de ensayo y
jaba en la síntesis de las sondas oligonucleótido que se
comprende varios ciclos, que incluyen a su
requerían. Con base en los experimentos llevados a cabo
vez tres pasos.
en 1971 por Kleppe et al.8, quienes desarrollaron el
primer sistema artificial de replicación con dos cebadores
La mezcla de la reacción consta de una
del que se tiene noticia, la idea de Mullis giraba en torno
pequeña muestra de ADN que se utiliza como
a descubrir cómo iniciar y además detener la acción de
molde y que se obtiene a partir de tejido
una enzima de tipo polimerasa sobre puntos específicos
fresco o aun de aquel que ha estado
de una sola de las cadenas del ADN, con el objetivo de
embebido en parafina. En adición, se amplificar el ADN blanco en forma exponencial. Enton-
necesitan oligonucleótidos que actúan como ces, mediante la utilización de dos cebadores, Mullis
cebadores, ADN polimerasa termoestable, consiguió que, después de aplicar en forma repetida la
desoxirribonucleótidos que se utilizan como polimerasa, se generara una reacción de replicación en
sustrato para copiar las cadenas nuevas a cadena que amplificó el segmento genómico de su inte-
partir del molde y un amortiguador que se rés9. Sin embargo, cuando quiso mostrar los resultados
encarga de estabilizar la reacción. de la amplificación, éstos no se pudieron visualizar en el
gel de agarosa, lo que lo llevó a pensar que la reacción
El primer ciclo de la reacción, conocido como en cadena no mostraba especificidad por la región
denaturación, consiste en separar las dos amplificada. Sin embargo, más adelante, estas dudas se
cadenas de la molécula de ADN, a una aclararon en forma satisfactoria, cuando los productos
temperatura entre 94 y 96°C, aplicada de la amplificación pudieron ser visualizados con la
durante pocos minutos. técnica Southern Blot. La visualización de la señal fue
la evidencia de la efectividad de la reacción en cadena de
A continuación se produce el anillamiento o la polimerasa, pues se comprobó que ésta era capaz de
hibridación de los cebadores con las amplificar el ADN de interés en forma específica. Estos
secuencias complementarias del ADN. Los resultados sirvieron además para optimizar las condi-
cebadores son oligonucleótidos sintéticos que ciones experimentales de la reacción. Desde comienzos
delimitan el sitio que se busca amplificar, y se de 1980, el ensayo Southern Blot (llamado así en honor
anillan a temperaturas que oscilan entre 50 y de su inventor Edwin Southern) adquirió mucha popu-
65°C. laridad en el ámbito del diagnóstico molecular, gracias
a su aplicación para descubrir secuencias génicas espe-
El último ciclo, o ciclo de extensión, toma cíficas y mutaciones responsables de enfermedades
entre uno y varios minutos a 72°C, lo que genéticas, así como de ciertos agentes infecciosos
permite a la ADN polimerasa sintetizar las (Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoea)10.
nuevas hebras de ADN, que serán La ejecución de este ensayo implica seccionar el
complementarias a las cadenas originales. ADN en fragmentos que contengan la secuencia o la
mutación de interés, para lo cual se utilizan enzimas de
A medida que avanza el proceso se logra restricción. Mediante electroforesis en un gel de agarosa,
amplificar el segmento deseado unas 107 los fragmentos se separan por tamaño y se transfieren a
veces. una membrana de nylon o de nitrocelulosa, con la
finalidad de obtener una réplica del gel. A continuación
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