Summary
Samenvatting methoden 2 RNA
- Course
- Institution
methoden 2 - deel 3 RNA
[Show more]
Seller
Follow
paulinebal
Reviews received
Content preview
2.3 RNAInleiding
DNA vs RNA
- Thymine (stabieler) vs uracil
- Deoxyribose: Geen 2’OH vs ribose: 2’OH
=> 2’OH vatbaar voor afbraak door RNAsen
DUS DNA stabieler dan RNA => makkelijk modificaties
- Ds vs ss
- RNA kan secundaire/tertiaire structuur hebben + korter dan DNA
(ddNTPs bij Sanger sequencing => ook geen 3’OH => geen ketenverlenging (fosfodiesterbinding))
Soorten RNA
tRNA => TLN naar eiwitten I mRNA = boodschap voor TLN
rRNA (95%) => veel aanwezig DUS voor kwaliteitscontrole (zie verder) Coderend RNA
lncRNA = lang (>200 nt) I siRNA = kort => moduleren cellen
miRNA = kort (<200 nt) => reguleren TXN (genexpressie) Niet coderend RNA
mRNA
DNA → pre-mRNA → mRNA (matuur) → polypeptide
Splicing = verwijderen intrionen
TXN splicing TLN
Pre-MRNA (tijdelijk) = 5’cap + exonen + intrionen + polyAstaart
mRNA: 5’cap + 5’UTR + 3’UTR + polyA => niet naar eiwit
5’cap en polyA niet gecodeerd maar post-transcriptie toegevoegd
Voorzorgen en bewaren voor problemen
Modificatie RNA in staal (RNA instabiel <>DNA)
= Degradatie (dmv endogene/exogene bv.RNAse) + inductie genen
- Anticoagulans EDTA bij staalname <> heparine (inhibeert RNA reactie)
RNA stabilisatie => langer bewaren
snel werk, inviezen (vloeib. N2),
RNA bewaarmiddel => langer bewaren bij Tkamer
→ bij bloed (bv.PAXgene tube)/ bij cellen bv. Trizol (1e stap extractie) of
RNAlater (voor extractie): (NH₄)₂SO₄ -opl. => neerslag eiwitten (RNAse = eiwit)
RNAse vrij werk
labojas, handschoenen, RNAse schoonmaakproduct,
buffer/water bewerken met RNAse inhibitor => nuclease-vrij
bv. DEPC (carcinogeen): reactie amines van AZ in katalytic site(!niet in Trisbuffer: Tris= amine)
, Bewaring RNA
In RNAse vrij water/ TE buffer (EDTA inhib. enkel DNAsen), op -80°C (1jaar <DNA),
als alcoholprecipitaat,, meerdere aliquots in RNA bewaarmiddel => later RNA extractie
DNA contaminatie bij RNA extractie
(!moeilijker DNA verwijderen van RNA dan RNA van DNA)
- Niet altijd probleem
- Detectie via electroforese of RTmin controle
DNAse behandeling ALS contaminatie WANT ook verlies/degradatie RNA
= DNAse(l) tijdens/na extractie RNA => knip DNA + hitte inactivatie/ verwijderen DNAse
RNA extractie
! vgl met DNA extractie
1)Lysis van staal = kapot maken cellen
= breken cellen (RNA vrij) => °lysaat/ homogenaat = vl. met inhoud cellen (afh. startmateriaal en
doel)
- Toep. lyseren: In extractie van DNA (Hfdst 1.13), RNA (Hfdst 2.3), eiwitten (Hfdst 2.4)
Vaak toevoeging remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNasen, RNAasen, proteasen,…
Methoden voor lysisch (afh. weefsel, celtype, V, …):
• Detergent toev. (meestal) bv. SDS, Trizol (guanidium thiocyanaat), guanidium chloride..=> lysis
• Vriezen en ontdooien (snel) => lyseren (kapot maken) cellen
( <> cryopreservatie (=traag) om cellen intact/leefbaar te houden: HT1.3)
• Mechanische homogenisatie:
o Pletten in mortier met pestel (in vloeibare stikstof)
o Bead-gebaseerde homogenisator:
beads (= kralen) in buis met cellen + schudden => °homogenaat
• Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator/ douncer:
oplossing tussen glazen pestels => bewegen => vloeistofstroom => lyseren cellen
Positief: milder: organellen intact (<> mechanische)
• Sonicatie (geluidsgolven) => OOK DNA/ RNA fragmenteren (bv. bij Sanger: DNA frag nodig)
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller paulinebal. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.95. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
78998 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now