Als voorbeeld een PWS geschreven over het onderwerp ''GFP in tumorcellen''. Het tussentijdse cijfer van hiervan was een 7.7 uiteindelijk afgerond naar een 8. Deze toevallig uitgekozen als inkijk model. Elke PWS die ik aanbied is 100% plagiaat vrij en uiteraard voldoende. Raad het wel aan om het nie...
Voorblad
Profielwerkstuk van Nikita Catsburg
Thorbecke Voortgezet Onderwijs, V6A
Profiel: Natuur & Techniek
Docent: Jacques Spelbrink, Scheikunde
Datum: 12-02-2019
,Inhoudsopgave
o Inleiding
o Onderzoeksvraag
o Methodologie en voorwoord
o Deelvraag 1. Hoe werkt GFP?
o Hoe werkt fluorescentie?
o Wat is GFP?
▪ Opbouw
▪ Fluorescerende eigenschap
▪ Toepassingen van GFP
o Deelvraag 2. Hoe kan het GFP-gen in het DNA van bacteriecellen worden ingebouwd?
o Bacterie
▪ Bouw
• Extracellulair
• Intracellulair
• Plasmide
▪ Escherichia coli
▪ Eiwitsynthese
• Transcriptie
• Translatie
- Initiatie
- Elongatie
- Terminatie
o Experiment: GFP-gen in pGLO-plasmide
o Deelvraag 3. Hoe kan het GFP-gen in het DNA van dierlijke cellen worden
ingebouwd?
o Dierlijke cel
▪ Bouw
▪ Tumoren
▪ Eiwitsynthese
o CrispR-cas9
o Voordelen cel traceren
o Conclusie
o Reflectie
o Logboek
o Literatuurlijst
o Bijlagen
o Bijlage 1. Werkwijze experiment
,Inleiding
Wat veroorzaakt precies het oplichten van een wit kleurend shirtje onder ultraviolette licht?
Het antwoord op deze vraag is het proces genaamd fluorescentie. Bij dit verschijnsel
absorbeert een elektron een foton met een hoge energie, waardoor het elektron naar een
hogere energiebaan springt en dus een hogere potentiële energie bezit dan de
grondtoestand (normale omstandigheden). In dit geval zegt men ook wel dat zo’n elektron
zich in een aangeslagen toestand bevindt. Hierna valt het elektron weer terug naar de
grondtoestand, oftewel de laagste energie toestand. Bij dit terugvallen, komt energie vrij in de
vorm van licht, wat binnen ons spectrum valt dus wat wij kunnen waarnemen.
Fluorescentie kent vele toepassingen. Bijvoorbeeld bij neon kleding onder blacklight (een uv-
lamp) in de disco, of ‘ een geheime inkt die je alleen kan zien met een Uv-lichtje’. Naast dat
fluorescentie kan worden gebruikt voor recreatieve doeleinden, zit er ook een medisch doel
aan. Door middel van een bepaald eiwit, het green fluorescent protein, (het groene
fluorescerende eiwit) afgekort GFP, kunnen gemodificeerde plasmiden die GFP uitscheiden bij
de translatie worden getraceerd met een Uv-lamp. Deze eiwitten bevatten namelijk een
fluorescerende eigenschap waardoor ze licht geven onder een uv-lamp.
Plasmiden komen voor in bacteriën. Deze methode kan ook worden toegepast op DNA van
eukaryoten, plasmiden bestaan immers ook uit DNA. Oftewel, in menselijke cellen zou het GFP
gen kunnen worden ingebouwd. Redelijk recent kwam er een nieuwe, relatief goedkope en
makkelijke techniek uit om DNA op een gewenste locatie in 2 stukken te knippen en een gen
naar interesse te laten inbouwen: De CrispR-cas9, afgeleid uit het afweersysteem van
bacteriën tegen virussen. Aangezien de eiwitsynthese bij menselijk DNA voortdurend blijft
doorgaan, blijft ook de aanmaak van groene fluorescerende eiwit doorgaan. Zo zou je dus
makkelijk menselijke cellen kunnen traceren. Op deze manier kunnen bijvoorbeeld ook
tumorcellen zo worden gemodificeerd dat ze het GFP gen ingebouwd krijgen, en krijgen ze
dus een soort marker met zich mee. Een eigenschap van een kwaadaardige tumorcel is dat
deze zich ongerept blijft delen. Wanneer zo’n tumorcel op voorhand al het GFP gen
ingebouwd heeft gekregen, zullen al deze nieuwe, ongerepte delingen van de kwaadaardig
geworden tumorcel óók het GFP-gen met zich mee dragen. Alle tumorcellen kunnen zo
worden gelokaliseerd en weggehaald worden. Mogelijke uitzaaiingen evenals, want alleen de
specifieke tumorcellen lichten op. Bovendien zo verder onderzoek worden gedaan naar het
gedrag van een tumorcel in een organisme.
Onderzoeksvraag
Hoe kan een menselijke tumorcel worden getraceerd door middel van een groen fluorescerend
eiwit?
,Methodologie en voorwoord
In februari 2018 waren profielwerkstuk presentaties waar ik, toenmalig als 5 vwo- er, verplicht moest
bijwonen. Niet dat ik het erg vond, in tegendeel: ik vond het zeer interessant. Rond die tijd begon ik
er een beetje achter te komen wat een profielwerkstuk was, wat het inhield en hoe veel werk dat
uiteindelijk zou zijn. Vooral vanwege de laatste reden, leek het mij verstandig alvast over een
onderwerp na te denken. Het examenjaar is vreselijk druk, en ik zou in mijn privé leven ook een erg
drukke agenda krijgen. Bovendien is het profielwerkstuk het laatste grote verslag op de middelbare
school: na 6 jaar lang ploeteren op het VWO wil je het toch wel afsluiten met een prachtige creatie
waar je trots op mag zijn, was mijn gedachtegang. En natuurlijk ook wat je leuk vind en wat je boeit.
Waar ik startte toen, was met het idee dat ik bij biologie mijn PWS zou maken. Concentratie en
aandacht leken mij boeiend, voeding en hersenen of aandacht problematiek. Maar ik besefte
uiteindelijk dat ik dat toch te psychologisch vond, en ik die kant niet op wilde gaan.
Ik vond het altijd wel interessant hoe blacklight werkte, en waarom precies een wit T-shirt oplichtte.
Ik schreef voor mijzelf allerlei ideeën op. Luminescentie, bioluminescentie, fluorescentie… Vóór de
zomervakantie leek mij iets met kristallen interessant. Misschien een nieuw (of weinig gebruikte)
kristal ontdekken wat ineens een fluorescente eigenschap heeft? Toen stelde ik mijzelf de vraag: wat
is het maatschappelijk doel van jou profielwerkstuk? Die zin bracht mij verder met nadenken. Ik
zocht internet af, en vond op de site van Universiteit Twente een artikel over iets wat een GFP
heette: een Groen Fluorescerend Proteïne. Een eiwit wat groen oplicht onder invloed van uv-licht. Ik
zocht verder informatie, en kwam er al snel achter dat dit in de kwal Aequorea victoria in 1962 voor
het eerst werd ontdekt.
Toen begon ik verder na te denken: ‘Als een kwal (dus dierlijke cellen) GFP aan kan maken… kan dit
dan ook in menselijke cellen?’ Maar waarom zou je dat willen in een menselijke cel? Ik wilde een
doel voor medisch belang, niet recreatief. Toen bedacht ik mij: wat als je iets met het GFP kunt
opsporen. Een tumor cel bijvoorbeeld? Als doktoren tumor cellen van menselijke cellen kunnen
onderscheiden door simpelweg een Uv-lichtje erop te laten schijnen, zouden in theorie zelfs
uitzaaiingen kunnen worden weggehaald, omdat deze allemaal kunnen worden opgespoord met
GFP. Ik werd super enthousiast. Voor en na de zomer kregen we de eerste informatie over PWS, en
werden er dagen ingeroosterd waar we met docenten konden praten etc. Mijn plan was hoog
gegrepen, maar ik had vertrouwen dat met genoeg werk ik er wat mee zou kunnen doen.
Al vroeg van te voren heb ik met een aantal universiteiten contact opgenomen. Mijn eerste plan was,
om te proberen onderzoek te doen met echte tumorcellen. Helaas was er nergens tijd, plaats en geld
om een leerling met haar profielwerkstuk te helpen (wat ik overigens zeker kan begrijpen). Ik ben
een dag naar Universiteit Wageningen afgereisd, waar ze een PWS-dag organiseerden waar
studenten van alle vakgebieden en uit verschillende leerjaren bereid waren te helpen. Ik heb een
hele hoop gesprekken gehad. Natuurlijk was wat ik wilde hoog gegrepen, maar het enige probleem
waar ik tegenaan liep was het praktisch onderdeel. Als ik niet met tumorcellen of GFP kon werken,
wat dan? Op school ligt zoiets ook niet zomaar. Een student van biotechnologie heeft mij toen een
site laten zien waar practica voor op scholen wordt verkocht, www.biorad.com. Zo zat er ook eentje
bij met precies wat ik nodig had: het inbouwen van een GFP-gen in een cel. Weliswaar in een
bacteriecel, maar ik kon met dit practicum in ieder geval onderzoeken hoe dit inbouwen werkt. Ik
vond het prachtige oplossing! Ik had op die dag mijn hoofdvraag afgebakend, een aantal deelvragen
bedacht en een praktisch onderdeel gevonden. Nu liep ik nog tegen één ding aan: de kosten. Het
practicum liep tegen de €100 aan, wat ik simpelweg niet had. Ik was bang dat nu heel mijn PWS
ontwerp in duigen zou vallen. Hoopvol stuurde ik mijn PWS-idee naar mijn begeleider.
Wat ik nooit had durven hopen, was uiteindelijk werkelijkheid geworden: de practicum-kit werd
vergoed door school. Hierbij wil ik mijn profielwerkstuk begeleider mnr. Spelbrink bedanken, voor
,zijn inzet voor mijn profielwerkstuk. Ook wil ik de afdeling natuurwetenschappen bedanken, voor het
goedkeuring van de vergoeding en het voor mij verkrijgen van de kit.
Wanneer ik het practicum binnenkreeg, bleek het een hoop werk te zijn. De stappen vóór het
practicum, wat normaal docenten als voorwerk deden, ging ik nu zelf doen. Hierbij wil ik mevr.
Koopman heel hartelijk bedanken voor al haar hulp bij mijn practicum. Zonder u zouden mijn
bacteriën nu niet oplichten.
De eerste stap was het maken van Agar bodems, voedingsbodems waarop bacteriekolonies onder
optimale omstandigheden optimaal kunnen groeien. Na een aantal dagen was het tijd voor stap 2:
De bacteriën enten, plasmiden dehydrateren, en in de warmtekasten stockeren. Hoe dit in detail in
zijn werk ging, kom ik op terug in Deelvraag 2. → experiment. Ik wil graag Aylin Özdemir bedanken
voor haar hulp bij de bacteriën enten.
De derde stap was uiteindelijk het practicum zelf: waar ik de bacteriën de pGLO-plasmiden met een
vooraf ingebouwd GFP-gen liet opnemen. Mijn dank gaat hierbij naar Sidney Hofman die mij heeft
geassisteerd bij dit practicum. In de tijd tussen de stappen van het practicum werkte ik aan de
deelvragen met behulp van literatuurstudie en de bijgeleverde informatie over het practicum. Na een
paar dagen wachten, haalde ik de bacteriën met de plasmiden en het GFP uit de warmte kast, scheen
ik er een Uv-lichtje op en tot mijn vreugde was het resultaat wat te zien is op het voorblad van dit
werkstuk: Mooie gescheiden kolonies E. coli bacteriën die door eiwitsynthese van de plasmiden waar
het GFP-gen zich bevind mooi groen oplichtten door het proces fluorescentie.
Om mijn hoofdvraag te beantwoorden, hoe een tumorcel zelf GFP gaat aanmaken, heb ik veel
literatuurstudie gedaan. Dit heb ik verwerkt in deelvragen. Met trots is hierbij mijn laatste grote werk
van het VWO op de middelbare school: Mijn profielwerkstuk over GFP in tumorcellen.
,Deelvraag 1. Hoe werkt GFP?
Fluorescentie
Fluorescentie is een vorm van luminescentie, het overgaan van atomen van een hogere naar een
lagere energietoestand. Het proces fluorescentie is een bijzonder geval. Bij dit proces wordt een
atoom bestraald met ultraviolette-licht (Uv-licht). Licht bestaat uit fotonen, ‘bundeltjes’ energie
zonder massa die bewegen met de lichtsnelheid. Onder invloed van het Uv-licht, absorbeert dit
atoom een hoog-energetisch foton. Als we naar de natuurkunde kijken, zien we dat hoe lager de
golflengte, hoe hoger de energie van het foton is:
Efoton = energie per foton (J)
h = 6,62606957·10-34 Js
Fotonenergie Ef = h·f = h·c/λ f = frequentie (Hz)
c = 2,9979·108 m/s
λ = golflengte (m)
Nu heeft Uv-licht een kortere golflengte (tussen 100 en 400 nanometer) dan ‘gewoon’ dag- of
zonlicht (gemiddeld tussen 400 en 780 nanometer) waardoor het een hogere fotonenergie heeft.
Hierdoor bezit Uv-licht het vermogen om een elektron van een atomenschil te laten verliezen.
Door een atoom te bestralen met Uv-licht, dus door fotonen met een hoge energie (γ-straling),
adsorbeert het elektron deze energie in dit atoom. Hierdoor heeft deze een hoger energie niveau en
verlaat dit elektron zijn elektronenschil. Hierdoor komt het elektron in een andere schil met een
hogere energie (per schil verschilt het ‘energieniveau’) (zie afbeelding 1.a.). Deze ‘situatie’ is echter
onstabiel, en kan niet lang standhouden. Na enige tijd springt het elektron dan ook weer terug naar
zijn originele elektronenschil en keert terug tot normale, stabiele fase.Dit ‘terugspringen’ noemen we
ook wel ‘emissie’. De elektron keert hierbij terug naar een lager energie niveau en bij de emissie
verliest het elektron dus zijn energie. Deze energie komt vrij in de vorm van fotonen, wat licht
veroorzaakt. (Zie afbeelding 1.b.) Dit is het licht wat binnen ons ‘zichtbaar licht’ spectrum valt, en wat
wij dus kunnen waarnemen. In het geval van een Green Fluorescent Proteïne is dit zichtbare licht
groen, wat betekent dat de golflengte tussen 495 - 566 nm ligt.
Afbeelding 1.a. Elektron van schil 2 naar schil 3 Afbeelding 1.b. Elektron van schil 3 naar
door energie van fotonen. schil 2 met vrijkomen van fotonen te zien als licht.
,GFP
GFP staat voor Groen Fluorescerend Proteïne oftewel een groen fluorescerend eiwit. Bij bestraling
met ultraviolet-licht (Uv-licht) zijn deze eiwitten zichtbaar doordat ze door fluorescentie een groen
licht uitstralen. (Op dit eiwit zijn later vele variaties gemaakt die bijvoorbeeld chemisch stabieler zijn,
of een andere kleur licht uitzenden → lees kopje ‘toepassingen van GFP’)
Opbouw
Een GFP is een eiwit wat is opgebouwd uit 238 aminozuren. De volledige aminozuur volgorde is te
zien in afbeelding 2.
Verder is GFP opgebouwd uit 11 β-sheets en 1 α-helix.
(Beide zijn een ander bepaald herhalend patroon van
aminozuren in een eiwit.) De structuur van de β-sheets en
de α-helix vormen zich door de waterstofbruggen die zich
vormen tussen NH-groepen en nabijgelegen CO- groepen.
(Zie afbeelding 3.)
Wat onder andere bijzonder is aan GFP is dat het zonder
de hulp van enzymen kan fluoresceren. Dit komt door een
patroon van 3 belangrijke aminozuren die zich in de α-
helix bevinden, namelijk: Serine, Tyrosine en Glycine op
plaats 65, 66 en 67 van de aminozuur volgorde (zie
afbeelding 2). De α-helix, en hiermee de aminozuren,
bevinden zich in het midden van het GFP, omringt door de Afbeelding 3. De structuur van een GFP
β-sheets. Deze aminozuren zijn zo dicht op elkaar gebonden dat ze
met elkaar een binding aangaan waaruit de chromofoor van GFP ontstaat. Dit zorgt voor de
fluorescerende eigenschap van GFP.
, Fluorescerende eigenschap
Chromofoor is het gedeelte van een molecuul met de eigenschap voor de adsorptie en het vrijkomen
van (zichtbaar) licht en hierdoor ook de kleur draagt. Het chromofoor in GFP is uiteindelijk
verantwoordelijk voor het verschijnsel fluorescentie in het proteïne.
De vorming van het chromofoor molecuul uit de aminozuren gaat als volgt: (zie afbeelding 4)
Moleculen en atomen bewegen voortdurend. Zoals we in afbeelding 4 kunnen zien, schijnt de NH
groep van Glycine67 vrij dicht bij de zuurstof groep van Serine65 te liggen. Door het continue
bewegen zijn er vaak botsingen. De NH-groep botst tegen de O-atoom waarbij de bindingen
verbreken en veranderen: Het H-atoom van de NH-groep bind met het O-atoom (er ontstaat hier OH)
en het koolstof atoom waar eerst deze O-atoom een dubbele binding was, gaat nu een binding aan
met het N-atoom wat eerst NH was. Er vormt zich een ‘ring van atomen’, dit proces heet dan ook
‘cyclisatie’ of ‘ringsluiting’. Hierna ‘dehydrateert’ het molecuul, waarbij H2O dus vrijkomt uit het
molecuul.
Voor de laatste stap is aanwezigheid van zuurstof essentieel: Oxidatie. Vanwege deze laatste stap
kan GFP overigens in anaerobe organismen geen chromofoor vormen, waardoor er ook geen groen
licht zou schijnen. Het gedehydrateerde molecuul reageert met O2 waarbij een dubbele binding
vormt tussen de twee cyclische groepen, waarbij het eindproduct het chromofoor molecuul is. In
afbeelding 4 is het chromofoor gedeelte wat het groene licht veroorzaakt d.m.v. fluorescentie groen
gekleurd.
Afbeelding 4. De reacties van de aminozuren naar het chromofoor molecuul.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller MaartjeBr. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $8.69. You're not tied to anything after your purchase.
