Samenvatting van het vak Genoom (BMW21614) van Biomedische Wetenschappen. Bevat de volgende onderwerpen: PCR, restrictie-enzymen, DNA-gelelectroforese, genomische banken en cDNA banken, overexpressie, fusie-eiwitten, reporter-genen, Sanger sequencing, Next Generation Sequencing, DNA-klonering, plaa...
DNA-technieken
Onderzoek
o PCR
o Restrictie-enzymen
o DNA-gelelectroforese
o Genomische banken en cDNA banken
o Overexpressie
o Fusie-eiwitten
o Reporter-genen
o Sanger sequencing
o Next Generation Sequencing
Manipulatie
o Restrictie-enzymen
o DNA-klonering
o Plaatsgerichte mutagenese
o Overexpressie
o RNA-interferentie (shRNA’s)
o CRISPR/Cas9 gene editing
Manipulatie/onderzoekstechnieken
RNA-interferentie
Plasmides, kloneren, kloneringsvectoren, expressievectoren, cDNA-banken, genomische banken
Fusie-eiwitten
Reporter-genen (GFP)
Inductie van bèta-galactosidase, spectrofotometer
SDS-PAGE en Western Blot
GST-pull down
Co-IP
ChIP
CRISPR/Cas9 gene editing
(In-situ) hybridisatie
Doel: lokalisatie RNA of DNA
Methode:
o Inbrengen korte stukjes fluorescerend DNA of RNA
o DNA: uitsmelten
o Hybridisatie op specifieke sequentie
PCR
Doel: DNA selecteren en vermeerderen voor onderzoek
Methode: thermocycling
o Denaturatie: dubbelstrengs enkelstrengs
o Annealing: baseparing primers
, o Elongation: enkelstrengs dubbelstrengs
Benodigdheden:
o DNA-fragment dat je wil vermeerderen
o Forward en reverse primer (die aan 3’ kant van fragment binden op beide strengen)
o DNA-polymerase
o dNTP’s
o Buffer
o Water
Voorwaarden primers:
o Complementair aan beide kanten gen
o Niet complementair aan elkaar
o Geen interne baseparing
o 15-30 baseparen lang
o Zo veel mogelijk uit G en C
RT-PCR
Doel: RNA selecteren, vermeerderen en vergelijken
RNA te instabiel als fragment in PCR RT-PCR
Methode: maken van cDNA
o Isoleren (m)RNA
o (m)RNA RNA/DNA met reverse transcriptase en poly-T-primer (bindt poly-A-staart)
o RNA/DNA DNA/DNA met RNA degradatie en DNA-polymerase (RNA als primer)
Welke cDNA’s dit oplevert is afhankelijk van de aanwezige RNA’s in het sample zaten
Kwantitatieve RT-PCR
o Twee cDNA’s worden vermeerderd met PCR
o Toevoegen eiwit dat fluoresceert als het dubbelstrengs DNA bindt
o Hoe meer DNA hoe meer fluorescentie
o Aantal cycli nodig om maximale fluorescentie te berijken: mate voor hoeveelheid mRNA
in sample
Plaats-specifieke mutagenese
Doel: specifieke mutatie aanbrengen
Methode:
o PCR met gemuteerde primer
o Primer bindt specifieke sequentie mutatie
o Replicatie
o Verwijderen bacterieel (gemethyleerd) DNA met DNP1
Restrictie-enzymen
Herkennen palindromische sequentie in DNA
o Sticky ends: 3’ of 5’ overhang
5’ overhang kan blunt gemaakt worden
3’ overhang niet
o Blunt ends: geen overhang
Doelen:
o Inbrengen gen in expressievector
o Sequentie-onderzoek: knipt enzym wel of niet
Methode: inbrengen gen in expressievector
o Restrictie-enzymen: knip gen uit insert vector
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