Summary
Samenvatting Gen- en genoomtechnologie
- Course
- Institution
Samenvatting van alle delen o.b.v. lesnota's, slides, youtube video's en boekmateriaal.
[Show more]
Seller
Follow
tessanuyttens
Reviews received
Content preview
1 Gen- en genoomtechnologieDeel 1: inleidende hoofdstukken
Chromosoom en genstructuur
DNA replicatie
Semi-conservatief mechanisme dat start bij de origin of replication (ori) semi-conservatief aangezien
na replicatie je altijd 1 parentale streng en 1 dochterstreng zal bekomen in het dsDNA. De ori is een AT-
rijk gebied minder H-bruggen, dus makkelijkere denaturatie ori is heel belangrijk bij kloneren!
Tijdens replicatie spreekt men van de leading en lagging strand:
leading strand is waar replicatie makkelijk van 5’ naar 3’
kan verlopen = in zelfde oriëntatie van het openen van de
replicatievork
lagging strand is waar replicatie gebeurt adhv Okazaki
fragmenten van 5’ naar 3’ = doordat synthese in de
tegengesteld richting van replicatievork gebeurt
De replicatievork onstaat door de helicase activiteit =
denatureren van dsDNA = uiteenhalen van de dubbelstrengen
zodat synthese van elke streng kan plaatsvinden.
Bij replicatie zal elke streng een DNA polymerase hebben die
bindt bij eukaryoten zal DNA pol α de lagging strand repliceren
en DNA pol δ de leading strand in totaal hebben eukaryoten 5
soorten DNA polymerase hebben allemaal hun eigen functie
verschillende technieken zullen hiervan gebruik maken.
Transcriptie en translatie
De verschillende stappen hiervan worden gereguleerd en bewaakt hierbij dienen we ook rekening te
houden in welk organisme we werken.
De genetische code wordt hier omgezet in een aminozuur code, welke vervolgens zal zorgen voor de
vorming van een eiwit (aminozuren die gecodeerd ≠ tussen nucleus en mitochondriën) beginnen
altijd bij een start codon = AUG, welke ook codeert voor Met eindigt altijd bij 1 vd 3 stop codons:
1. Amber = UAA
2. Ochre = UAG
3. Opal = UGA
Bij transcriptie en translatie speelt de genstructuur ook een belangrijke rol in prokaryoten = genen
voor een bepaalde processen samen in een operon, bij eukaryoten bevinden deze genen zich vaak
echter op ≠ chromosomen vb. voor trp operon en TRP-genen:
Prokaryoot: start code dient voor het overschrijven van meerdere genen (transcriptie) mRNA
bevat geen cap en geen polyA verschillende
start sites van proteïne synthese (translatie)
Eukaryoot: elk gen is afzonderlijk voorzien van
een start codon maakt transcriptie complexer
door RNA processing hebben mRNAs cap en
polyA elke mRNA heeft een translatie start site
,2 Gen- en genoomtechnologie
Controle van transcriptie
Gebeurt door de transelementen (bv. TBP = TATA-binding protein) die binden aan hun respectievelijke
ciselementen (bv. TATA-box) dicteren wanneer DNA actief is en DNA kan enkel overgeschreven
worden als alles aanwezig is.
De verschillende controlemechanismen van transcriptie kunnen ook toegepast worden in technieken,
zoals bv. TAD boundaries, ChIP-seq, 4C seq, in situ Hi-C en PROseq.
Bij eukaryoten scheiden de insulators het heterochromatine
(compact/inactief) van het euchromatine (los/actief) DNA
transfactoren kunnen hieraan binden om zo gebieden af te bakenen
CTCF is een Zn-vinger dat kan binden op DNA speelt een
belangrijke factor in imprinting = activatie/inhibitie van
maternaal/paternaal DNA CTCF kan niet binden op een
gemethyleerd insulator element
Cis-regulatorische sequenties in het DNA zullen er ook voor zorgen dat binnen een insulated domein het
juiste gen zal worden afgeschreven.
Algemene transcriptie en RNA processing
Op gDNA niveau bevindt zich voor het startcodon de 5’-UTR en na het stopcodon de 3’-UTR zijn niet
vertaalde regio’s welke belangrijke regulatorische elementen bevatten.
Alvorens mRNA matuur is, bevat deze nog geen cap en polyA en zijn de intronen nog steeds aanwezig
door splicing zullen de intronen verwijdert worden de splice sites bevatten een consensus
sequentie welke de 5’-splice site (splicing donor = SD) en de 3’-splice site (splicing acceptor = SA)
worden genoemd.
Sequenties worden door snRNPs herkent
vorming van lariat structuur
verwijdering van intron
snRNPs bevatten snRNA welke hun gidst
naar het pre-mRNA voor splicing
Alternatieve splicing
Dit komt door de variatie in de SD en SA zorgt voor 5 algemene vormen van splicing. Alternatieve
splicing zorgt ervoor dat met een relatief klein aantal genen een grote verscheidenheid aan proteïnen
geproduceerd kunnen worden alvorens dit gekend was, was het
verwacht aantal eiwitcoderende genen enorm groot.
,3 Gen- en genoomtechnologie
Vorming van circulaire RNA’s
Splicing kan gebeuren in meer dan 1
richting wanneer splicing in de andere
richting gebeurt bekomt men circulair
RNA = gelijkaardig aan lariat structuur
kan op 3 verschillende manieren
bekomen worden.
RNA editing
Hierbij wordt er bv. een edit ingevoerd op RNA niveau (niet aanwezig op DNA niveau) welke zorgt voor
het invoeren van een stopcodon voor een kortere versie van een eiwit een eiwit dat zo’n edits van
uitvoeren op RNA niveau is ADAR (adenosine deaminase acting on RNA) = eiwit dat een I base invoert
door deaminatie van A.
Cis- en transelementen
Een aantal belangrijke cis-elementen zijn de TATA box, BRE (branchpoint region), INR (initiation region),
DPE (distal promotor element), CRE (cAMP respons element), …
GC-box en CAAT-box elementen kunnen een andere oriëntatie hebben.
Transcription factories
Chromosomen moeten met elkaar kunnen communiceren = co-regulatie van genen gebeurt door
lusvorming van chromosomen waardoor er efficiënt gebruik gemaakt kan worden van RNA polymerase
en transcriptiefactoren.
CTCF bindt een CCCTC sequentie en zal ervoor zorgen dat meerdere genen tegelijkertijd tot expressie
kunnen komen adhv rosette vorming = chr lussen die gevouwen worden in een rosette structuur.
Hierbij worden non-homologous chromosomal contacts (NHCCs) gevormd
Recombinante DNA technologie
Wordt gebruikt voor het begrijpen van cellulaire functies op moleculair niveau bv. up/downregulatie
van een gen, bevat het gen een mutatie, …
Het gekloneerde fragment kan geanalyseerd worden
Gen inactivatie door mutant fenotype
Expressie profiel of nagaan van cellulaire lokalisatie
Gen functie afleiden uit sequentie
Ook kan het gekloneerde fragment gebruikt worden voor eiwitproductie bv. voor aanmaak van
vaccins eiwitproductie kan bv. ook meer zeggen over de biochemische activiteit + bepaling van
structuur.
Extractie en zuivering van genomisch DNA
DNA isolatie kan gebeuren uit weefsel, maar ook voor de afzondering van vectoren, virussen en fagen,
bacteriën en cellen.
Voor DNA te zuiveren uit een van deze systemen is er nood aan lyse:
1. Mechanisch = verpulveren van de cellen
, 4 Gen- en genoomtechnologie
2. Chemisch = enzymatisch verteren
→ Afbraken van de celwand
→ SDS toevoegen voor verwijderen van vetten
→ SE lyse buffer bevat sodium chloride (fysiologische oplossing) en EDTA = chelator
(complexeert met metaalionen voor inactivatie van enzymen)
→ Verlaging van de temperatuur zodat eiwitten en enzymen minder actief zijn voor
bewaring bij -80°C
→ Eiwitdenaturerende agentia, zoals detergenten en fenolen om DNA afbraak te
voorkomen
Meten van DNA concentratie
Centrifugatie kan op sucrose gradiënt, door snelheidscentrifugatie, door dichtheitcentrifugatie (CsCl)
met EtBr.
De concentratiebepaling gebeurt
→ UV spectrofotometrisch adhv de OD 260/280 verhouding waarden tussen 1,8-2,0 = zuiver
DNA
→ Adhv agarose gelelektroforese
→ Nanodroptechnologie
Detectie hierbij gebeurt met een UV-illuminator, laser scanner, polaroid of CCD camera.
Meten van de concentratie kan door kwantificatie in oplossing adhv fluorescente dyes: SYBR green
(DNA), Pico-green (dsDNA), Ribo-green (RNA), GelRed (1ng dsDNA, ssDNA of RNA) hierbij wordt de
dye voor ~5min geïncubeerd met het staal waarna fluorescentie gemeten wordt fluo-kleurstof op
zichzelf geeft een laag signaal, maar als het intercaleert geeft het een hoog signaal signaal wordt
gemeten adhv RTQ-PCR (real-time quantitative PCR).
Toepassingen
Toepassingen Bepaling PCR Automatische Opsporen van Monitoring DNA
amplificatie kwantificatie DNA contaminatie plasmide
in eiwit extracten productie in
of Al-bereidingen bacterieculturen
Affiniteitschromatografie Drager = cellulose, agarose of Oligo (dT)n voor binding van polyA
sepharose van RNA
Speciale dragers Cellulose Geactiveerd Hydroxyl-apatiet Nylon
nitraat (dsDNA) papier (DBM,
APT)
Opzuiveren van Bv. met paramagnetische parels
nucleïnezuren
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller tessanuyttens. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $27.68. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
77254 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now