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Apuntes de Biología molecular
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Apuntes de biomol relacionados con la técnica de la PCR.
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jannaasamperr
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Bases teóricas de la PCRTécnica de amplificación in vitro de DNA que permite obtener millones de copias iguales de un
fragmento concreto de DNA, partiendo de una cantidad mínima de DNA molde (hasta 10 kb).
Aplicaciones: diagnostico de enfermedades, evolución y respuesta a tratamientos, estudios de
expresión genética…
Proceso enzimatico catalizado por una DNA polimerasa.
Ideada en 1983 por K. Mullis
LOS PRIMERS
Secuencias de DNA complementarias que flanquean el
fragmento que se quiere amplificar.
Se diseñan por parejas.
Están en extremos y cadenas opuestas.
❖ Reverse Primer: se une a la hebra molde 5’-3 ’ (+).
Pero va de 3’-5’.
❖ Forward Primer: se une a la hebra molde 3’-5’ (-).
Y codifica en la misma dirección.
Requisitos:
❖ Longitud: 18-25 bases (20 aprox)
❖ Composición 40-60% G+C: se recomienda que el extremo del cebador 3’ sea una G o C,
también que no haya secuencias de 3 o más G-C.
❖ Secuencia: Intra y intermolecular no complementaria
❖ Temperatura de fusión (Tm): 52-70 ºC. La diferencia entre la pareja de primers: <5ºC
DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES
Enzimas aisladas de un grupo de bacterias (termófilas), con actividad polimerasa a temperaturas
elevadas.
Funcionan a Tª elevada (óptima: 70 – 75 ºC)
Actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación a 95oC (> 40 min.)
❖ Taq: no son capaces de corregir errores.
❖ High fidelity: detectan el nucleótido erróneo, lo cambian por el correcto, y siguen.
❖ Retrotranscriptasa: tasa de error muy elevada. Actividad de transcriptasa inversa.
CICLO BÁSICO DE UNA PCR
1. Desnaturalización (90-95ºC, 15-30s): Separación de las cadenas.
2. Hibridación (50-65ºC, 30-60s): a temperaturas muy elevadas hay mayor especificidad, a
temperaturas más bajas, la hibridación es mas fácil pero aparecen productos no deseados
por baja especificidad de los primers.
3. Extensión: Elongación de los primers por la DNA polimerasa copiando la hebra molde. La
temperatura de polimerización depende de la enzima empleada, el tiempo por la longitud.
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